РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Об'єктами наших досліджень були діюча субстанція, отримана на кафедрі
фармакогнозії НФАУ доцентом Ковальовою А. М. з трави гороху посівного – Pisum
sativum L. (сем. бобові – Fabaceae), і створена на її основі таблетована
лікарська форма “Піфламін” на дослідному заводі ДНЦЛЗ. Спосіб отримання та
гепатопротекторна дія субстанції та таблеток піфламіну захищені патентом
України [163].
Субстанція піфламіну за фізичним станом є гігроскопічним порошком від
світло-коричневого до коричневого кольору, розчинна у воді, помірно розчинна в
50% спирті, практично нерозчинна в хлороформі і 96% етиловому спирті.
Субстанція є природним комплексом БАР, який було встановлено методами
фітохімічного і фармакогностичного аналізу. Основні діючі речовини піфламіну
представлені поліфенольними сполуками з групи біофлавоноїдів і гідроксикоричних
кислот (рис. 2.1). Характерними флавоноїдними глікозидами є моно-, ди- і
триглікозиди кверцетину та кемпферолу, які часто ацильовані по кінцевому
цукровому залишку. Основні флавоноїдні сполуки піфламіну - кверцетин
(3,5,7,3ў,4ў-пентагідроксифлавон), кемпферол (3,5,7,4ў-тетрагідрокси-флавон) та
їх глікозиди: кверцетин-3-О-софорозидо-п-кумарат,
кверцетин-3-О-софоротриозидо-п-кумарат,
кемпферол-3-О-софоротриозидо-п-кумарат.
Мінорні інгредієнти препарату представлені наступними флавоноїдами: лютеоліном
(5,7,3ў,4ў-тетрагідроксифлавон); апігеніном (5,7,4ў-тригідрокси-флавон);
кемпферол-3,7- диглюкозидом; кверцетином (3,5,7,31,41-пентагідрокси-флавон);
кверцитрином (кверцетин-3-О-a-L-рамнозид); ізокверцитрином
(кверцетин-3-О-bb-D-глюкопіранозид); гіперозидом
(кверцетин-3-О-bb-D-галакто-піранозид); рутином (кверцетин-3-О-рутинозид);
біокверцетином (кверцетин-3-О-bb-D-галактозил-a-L-рамнозид); антозидом
(кверцетин-3-О-bb-D-глюкозид-7-О-L-рамнозид); кверцетин-3-О-софорозидом.
Гідроксикоричні кислоти представлені п-гідроксикоричною (4- гідрокси-
ФЛАВОНОЇДНІ АГЛІКОНИ
Лютеолін Кверцетин
(5,7,31,41 – тетрагідроксифлавон) (3, 5,7,31,41-пентагідроксифлавон)
Кемпферол
(3,5,7,41- тетрагідроксифлавон)
ГІДРОКСИКОРИЧНІ КИСЛОТИ
Ферулова кислота п-Гідроксикорична кислота
(4-гідрокси-3- (4-гідроксикорична кислота)
метоксикорична кислота)
Рис. 2.1 Фенольний склад піфламіну
коричною), феруловою (4-гідрокси-3-метоксикоричною), кавовою, хлорогеновою,
неохлорогеновою кислотами.
До комплексу БАР субстанції входять і азотовмісні сполуки: амінокислоти та
гуанідіни. Амінокислотний склад піфламіну представлений 7 незамінними (треонін,
метіонін, валін, лейцин, ізолейцин, лізин, фенілаланін), 2 напівзамінними
(гістидин, аргінін) і 6 замінними (аспарагінова кислота, глутамінова кислота,
серин, гліцин, аланін, цистеїн) амінокислотами. Основним компонентом
гуанідинових сполук є алантоїн (5-уреїдо-гідантоїн).
Піфламін також містить олігосахариди - софорозу, рутинозу, робінобіозу та ін. У
кислотному гідролізаті полісахаридного комплексу піфламіну було виявлено
глюкозу, галактозу, рамнозу, галактуронову та глюкуронову кислоти.
До складу субстанції піфламіну надходять також макро- та мікроелементи (мас.%):
B – 0,0018; F – 0,019; Na – 0,4; Mg – 0,83; Al – 0,0074; Si – 0,07; P – 0,15; S
– 0,53; Cl – 0,32; K – 2,64; Ca – 0,19; Mn – 0,0017; Fe – 0,0043.
Таблетки піфламіну покриті оболонкою оранжевого кольору з двоякоопуклою
поверхнею, на поперечному зрізі видні два шари. Вони містять по 0,125 мг
субстанції, допоміжні речовини (цукор молочний, стеарат кальцію,
карбоксиметилцелюлоза, стеарат магнію, титану двоокис, метилцелюлоза, тропеолін
О) до 0,4 мг (з оболонкою).
Основним препаратом порівняння був обраний аналог піфламіну за гепатозахисною
дією – силібор, біофлавоноїдний гепатопротектор з плодів розторопші плямистої
виробництва ФК “Здоровўя” (м. Харків, Україна). Його доза при проведенні
досліджень в системі in vitro підбиралась шляхом скринінгу, в системі in vivo –
склала 25 мг/кг, як ЕД30 за гепатозахисною дією [66]
Враховуючи поліфенольний склад досліджуваної субстанції, вивчення
фармакологічних властивостей піфламіну починали з визначення його
антиоксидантної активності в системах in vitro та in vivo.
В умовах in vitro проводили скринінгові дослідження по визначенню сумарної
антиокисної активності піфламіну за критерієм здатності субстанції гальмувати у
суспензії жовточних ліпопротеїдів (ЖЛП) накопичення продуктів ПОЛ, які реагують
з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [95]. Дослідження проводили у порівнянні з
гепатопротектором-антиоксидантом - силібором і класичними антиоксидантами -
іонолом виробництва фірми “Sigma” (США) та a- токоферолом виробництва фірми
“ISN” (США). Екстинкцію ТБК-активних продуктів реєстрували на спектрофотометрі
СФ-46. Антиокисну активність виражали в % інгібування окиснювання ЖЛП.
Вивчення антиоксидантних властивостей субстанції піфламіну в системі in vivo
проводили на білих мишах масою 25-30 г в умовах гострого токсичного гепатиту,
який викликали введенням тетрахлорметану [71,202]. Одночасно проводили скринінг
по виявленню залежності антиоксидантних властивостей препарату від дози в
діапазоні від 25 до 150 мг/кг. Дослідження проводили в порівнянні з вітаміном Е
(виробництва ЗАТ “Київський вітамінний завод”, Україна) у дозі 50 мг/кг (в
першій серії дослідів) і силібором у дозі 25 мг/кг (в другій серії дослідів)
[66,,145]. Після попереднього 24-годинного голодування без обмеження прийому
води дослідні тварини одержували перорально піфламін, вітамін Е і силібор,