Окислювальна конверсія етанолу в ацетальдегід клітинами метилотрофних дріжджів

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Об’єкт дослідження.
Штами метилотрофних дріжджів, використані у роботі, представлені у табл. 2.1.
Таблиця 2.1.
Використані штами метилотрофних дріжджів.
Вид, штам
Генотип
Фенотип
Походження,
літературне джерело
H. polymorpha
356
leu2
дикий тип
Колекція Л.П. Тихомирової (Інститут біохімії і фізіології мікроорганізмів,
м. Пущино, Росія)
22
leu10
дикий тип
Колекція Dr. P.Sudbery (Sheffield University, UK)
LR9
ura3
дикий тип
(Дюссельдорф, ФРН)
А3
fdr adr
adh
мутант, дефектний по формальдегідредуктазі, ацетальдегідредуктазі і частково
алкогольдегідрогеназі
[42]
A3-16
fdr adr
adh
ald
мутант, похідний штаму А3, з блоком редуктази ацетальдегіду і
альдегіддегідрогенази
[33], дана робота
33
leu10
gcr1
мутант з порушеною глюкозною катаболітною репресією ферментів метаболізму
метанолу
[33, 38, 336], дана робота
К-105
gcr1
catX
мутант із знятою глюкозною катаболітною репресією та повним блоком каталази
[37, 337]
S-47
gcr1
catX
мутант з порушеною глюкозною катаболітною репресією, конститутивним синтезом
алкогольоксидази в середовищі з глюкозою і повним блоком каталази
[33]
Продовження таблиці 2.1.
Вид, штам
Генотип
Фенотип
Походження,
літературне джерело
356-83
fld
мутант з дефектною формальдегіддегідрогеназою
[114]
33-7
33-7A
7-4A
gcr1
gcr1
gcr1
EAO
мутанти, похідні штаму 33, з підвищеною питомою активністю алкогольоксидази
[33, 36], дана робота
33-7-62
33-7-30
gcr1
adr
adh
gcr1
adr
adh
мутанти, похідні штаму 33-7, дефектні по ацетальдегідредуктазі і частково по
алкогольдегідрогеназі
дана робота
7-4А’
7-4AF33
gcr1
EAO
gcr1
EAO
acs
мутанти, похідні штаму 7-4А, з пошкодженою етанольною інактивацією
алкогольоксидази, останні мутанти – резистентні до 2-фторацетату, з блоком
ацетил-КоА синтетази
[36], дана робота
P. methanolica
MH4
дикий тип
Колекція
І.І. Толсторукова (Інститут генетики і селекції промислових мікроорганізмів,
м. Москва, Росія).
2230
2468
2480
arg1acs1
arg1acs2
ade2acs3
мутанти з блоком ацетил-КоА синтетази
[35, 38, 123]
798
ade2his1
his4icl1
мутант з блоком ізоцитратліази
[35, 38, 123]
2113
arg1ade2
mdd1
мутант з блоком малатдегідрогенази декарбоксилюючої або “малік” ферменту
[35, 123]
2094
arg1ade2
pck1
мутант з блоком фосфоенолпіруваткарбоксикінази
[123]
2.2. Умови зберігання та культивування дріжджів [39, 118].
Штами зберігали на скошеному 2-2,5% агарі (при темпера­­­турі 4о-6о С) з повним
середовищем на основі пивного сусла (середовище сусло-агар), розведеного водою
у співвідношенні 1:1.
Клітини дріжджів вирощували на чашках Петрі з агаром в термостаті ТС-80М-2 при
30о або 37о С чи в колбах на шейкері (200 об./хв) при 30о С в умовах аерації до
середини експоненційної фази росту (до концентрації клітин 0,8 - 1,2 мг/мл) у
середовищі такого складу (на 1л): 1) макроелементи: KH2PO4 - 1 г; (NH4)2SO4 -
3,5 г; MgSO4 x 7 H2O - 0,5 г; CaCl2 - 0,1 г; 2) сіль Мора ((NH4)2SO4 x FeSO4 x
6H2O) - 1,4 мг; 3) в якості джерела мікроелементів і вітамінів використовували
дріжджовий екстракт "Difco" - 0,5 чи 1,0 г; 4) фактори росту ауксотрофних
мутантів: амінокислоти (аргінін, лейцин, гістидин, метіонін) та азотисті основи
(аденін, урацил) - ­­­40 мг; 5) концентрація джерел вуглецю (сахарози, глюкози,
гліцерину, етанолу, ацетату, мета­­­нолу) в ростовому середовищі (якщо не
вказано інакше) складала 1%. Метанол та етанол додавали до середовища після
стерилізації.
2.3. Отримання та відбір мутантів.
Мутації індукували УФ-світлом (помилки у репарації – фотореактивації, темновій
ексцизійній, постреплікативній та індукованій SOS репарації, адаптивній
відповіді, основних УФ-продуктів – димерів сусідніх піримідинів в одному
ланцюгу ДНК, об’єднаних циклобутановим кільцем). Потужність джерела
випромінювання (лампа БУВ-15) – 125 Вт, довжина хвилі – 235 нм, відстань до
об’єкта – 200 мм. Використову­­­вали дозу опромінення (50 ерг/мм2), яка
забезпечувала близько 10% виживання клітин. Для мутагенізації використовували
суспензію клітин одно-дводобової культури з оптичною густиною Е540 = 0,320 (15
х 106 клітин/мл). Після опромінення на протязі 40 сек і ряду розведень
суспензію висівали на чашки для отримання густини засіву ­­­100-150 колоній на
чашку. Аналізували щонайменше 10-20 тис. ко­­­лоній. Визначали титр клітин та
частоту виникнення мутантів.
2.3.1. Отримання мутанта 33 [33, 38, 336].
Штам 33 (leu10 gcr1) отримано після опромінення УФ-світлом клітин штаму 22
(leu10) H. polymorpha. Мутанти відбирали методом позитивної селекції за ознакою
росту на агаризованому середовищі із сумішшю 1% мета­­­нолу і
2-дезокси-D-глюкози (аналога глюкози, що не метаболізує, але викликає
катаболітну репресію синтезу ферментів утилізації метанолу [23, 35, 39]).
Використовували концентрації 2-дезокси-D-глюкози від 10 до 50 мг/л. Відбір
проводили на основі визначення активності алко­­­гольоксидази безпосередньо в
дріжджових колоніях, які виросли на середовищі з глюкозою [338]. В результаті
утворення перекису водню з метанолу та окислення ортодіанізидину у присутності
пероксидази хрону, колонії, які володіли активністю ал­­­когольоксидази,
забарвлювалися у бурий колір. Cклад реакційної суміші для визначення активності
алкогольоксидази в колоніях (на 100 мл): орто­­­діанізидин - 25 мг; тріс-HCl (1
М буфер, рН 8,0) - 5 мл; H2O - ­­­88 мл; агар - 300 мг; дигітонін - 100 мг;
пероксидаза з активністю 350-500 Од/мг (1 мг/мл) - 5 мл; метанол (0,2 М) - 2
мл. Проаналізовано 265 колоній, резистентних до 20 мг/л 2-дезокси-D-глюкози на
середовищі з 1% метанолом. Активність алкогольоксидази виявлено у 96 колоній,
які виросли на середов