РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкт та умови дослідження
Для вирішення поставленої мети та завдань дослідження були проведенні на 130 білих статевозрілих щурах-самцях масою 0,18-0,22 кг. Утримання, годування та евтаназію (шляхом декапітації) лабораторних тварин проводили згідно з загальноприйнятими в експериментальній практиці методами [107]. Об'єкт дослідження - печінка, мозок, кров щурів.
Для визначення резистентності щурів до етанолу використали тест на тривалість етаноліндукованого сну [32]. З цією метою щурам вводили 25%-ний розчин етанолу доочеревно в дозі 4 г/кг маси. За даними Українського інституту клінічної та експериментальної неврології та психіатрії цю кількість етанолу вважають дозою середньої токсичності (її величина відповідає 1/4 летальної дози і найчастіше використовується для вивчення токсичних впливів етанолу на процеси метаболізму) [17]. Після введення розчину етанолу реєстрували час перебування тварин у боковому положенні і, відповідно, тварин поділили на короткосплячих і довгосплячих. У експериментах для вивчення впливу ІГТ використовували ДСп щурів з підвищеною резистентністю до етанолу.
Поділ тварин за резистентностю до гіпоксії проводили за методом Березовського В.Я. [16], через тиждень після тестування на етаноліндукований сон. Для виявлення індивідуальної стійкості до гіпоксії щурів поміщали в приточно-витяжну барокамеру та моделювали підйом на "висоту" 11000 м (швидкість підйому 150 м/с). Критерієм стійкості тварин до нестачі кисню слугував час від моменту підйому на "висоту" 11000 м до появи другого агонального вдиху. Для відтворення в експерименті ранніх стадій алгогольної інтоксикації, нами була обрана модель, при якій щурі-самці як єдине джерело пиття отримували 15 %-ний розчин етанолу впродовж 30 днів. Добровільна алкоголізація, згідно з даними літератури [32], є найбільш оптимальною моделлю, дозволяє врахувати генетичні, індивідуально-типологічні особливості тварин, у яких виникає алкогольна залежність. У процесі експерименту контролювали об'єм спожитого етанолу. В середньому одна тварина випивала біля 9,5 мл 15 %-ного розчину етанолу на добу (1,5 г чистого алкоголю). Контролем слугували тварини тієї ж вікової групи, які як джерело рідини отримували воду.
Враховуючи дані фахової літератури [32, 150] про вираження симптомів хронічної алкогольної інтоксикації через 30 днів після початку алкоголізації і керуючись власними спостереженнями (зафіксовано виражений потяг до алкоголю) забій щурів шляхом декапітації проводили на 31-шу добу від початку експерименту.
Окремі групи контрольних та алкоголізованих тварин в подальшому підлягали впливу інтервального гіпоксичного тренування, яке здійснювали у різні періоди алкоголізації.
Була проведена серія досліджень, у якій ІГТ застосовували після 30-ти денного споживання спирту. ІГТ проводили в барокамері в наступному режимі: п'ятиразовий "підйом" на "висоту" 6000 м по 10 хв, перерви між експозиціями гіпоксії - 15 хв, тривалість тренувань - 10 днів, швидкість "підйом" - 20 м/с [170, 235]. Група контрольних тварин також підлягала гіпоксичному тренуванню.
У наступній серії досліджень ІГТ було застосоване на початку алкоголізації, а саме з 1-ого по 10-ий день вживання етанолу.
Для біохімічних досліджень використовували сироватку крові, цільну кров і гомогенати тканин печінки, мозку дослідних та інтактних тварин. Забір крові та тканин проводився після забою тварин. Гомогенізацію органів проводили в охолодженому фізіологічному розчині при розведенні 1:10. Тканини промивали охолодженим фізіологічним розчином, подрібнювали і гомогенізували у гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при швидкості 200 об/хв і п'яти вертикальних ходах пестика (м'яка гомогенізація).
Обстежено 53 пацієнти чоловічої статі віком 24-40 років, що перебували на лікуванні у Львівському обласному наркологічному відділенні з приводу алкоголізму ІІ стадії. Контрольна група налічувала 20 практично здорових непитущих чоловіків віком 20-40 років. Для біохімічних досліджень використовували сироватку крові, цільну кров та слину. З метою виключення можливого впливу прийому їжі та добових біоритмів на біохімічні показники, забір крові з ліктьової вени усім хворим проводився натще, до прийому їжі, у часовому інтервалі з 800 до 900. У крові обстежених визначали вміст продуктів ПОЛ (який фіксували за нагромадженням МДА), активність ферментів антиоксидантного захисту - супероксиддисмутази та глутатіонпероксидази, а також вміст лімітуючих субстратів деяких шляхів метаболізму - молочної та сечової кислот. Для визначення концентрації аскорбінової кислоти в слині хворих використовували метод Selgrage M.J.K. et al. [295].
2.2. Біохімічні методи дослідження
Зміни кисеньзалежного метаболізму та детоксикаційних систем (процеси ПОЛ, енергетичний обмін, детоксикаційна здатність печінки) вважаються провідними ланками у реалізації клітинних ефектів дії етанолу, тому важливо дослідити їх при дії акоголю, а також за умов корекції методом інтервального гіпоксичного тренування.
Рівень ПОЛ в гомогенатах печінки, мозку і сироватці крові оцінювали за вмістом первинних продуктів цього процесу - дієнових кон'югатів і за нагромадженням одного з вторинних продуктів - малонового діальдегіду (МДА).
Вміст дієнових кон'югатів визначали за методом Плацера в модифікації Гаврилова В.Б., Мішкорудної М.І. [50]. Принцип методу полягає в екстрагуванні ліпідів за допомогою суміші гептан-ізопропанол (1:1) з наступним визначенням оптичної густини гептанового шару при довжині хвилі 233 нм, який відповідає максимуму поглинання вуглеводневих ланцюгів з кон'югованими (спряженими) подвійними зв'язками, які утворюються внаслідок внутрішньомолекулярного перегрупування на початковому етапі ПОЛ. Використання коефіцієнтів молярної екстинції окремих ліпідів у даному випадку утруднене через складність і мінливість ліпідного складу біологічного матеріалу, тому результати виражали в одиницях оптичної густини в перерахунку на мл чи
- Киев+380960830922