РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Методика лабораторних досліджень
Зимостійкість - складна ознака, яка включає стійкість рослин до низьких від'ємних температур і інших несприятливих факторів середовища. Найбільш ефективним методом оцінки зимостійкості є польовий метод [48]. Але застосування такого комплексного методу у зв'язку з варіацією погодних умов можливий не у всі роки досліджень. Тому для додаткової характеристики зразків на зимостійкість проводять проморожування насіння [45], результати, якого дають інформацію щодо чутливості лядвенця рогатого до зниженої температури.
Метод проморожування насіння. З цією метою зволожене насіння пророщують до величини проростків 3-6 мм, потім витримують при температурі -7, -10, -120С протягом 12-24 год. і підраховують кількість пророслих та непророслих насінин. Цей метод менш трудомісткий, не потребує місця для вирощування рослин, однак повністю не відтворює адаптацію рослин до від'ємних температур, оскільки осіннє загартування рослин відрізняється від проморожування пророслого насіння [41].
Для отримання більш надійних результатів морозостійкість рослин визначали проморожуванням їх в холодильних камерах (в монолітах). Температуру в морозильних камерах після перенесення туди рослин в монолітах, доводили поступово до заданої температури на протязі 24 год. Кількість рослин, що збереглися, підраховували на 20 добу після вирощування [106].
Визначення вмісту суми відновлюючих цукрів за Починком [107].
У наважку матеріалу добавляли 10%-ний розчин сірчанокислого цинку з розрахунку 1,5 мл на кожен грам наважки. Потім доливали 0,4 н. розчину NaОН в 1,5 рази більше, ніж додано розчину сірчанокислого цинку, доводили об'єм водою до мітки, перемішували і фільтрували в суху колбу через сухий фільтр. В фільтраті визначали відновлюючі цукри (глюкоза + фруктоза + мальтоза), фруктозу і суму цукрів (відновлюючі цукри + сахароза).
З метою подальшого вивчення зимостійкості досліджуваних зразків лядвенця рогатого, оцінки якості, а також аналізу зміни біохімічних ознак в процесі вегетації в конкретних умовах Закарпатської області нами вивчався вміст сухих речовин, протеїну, клітковини, каротину, аскорбінової кислоти.
Вміст сухих речовин в рослині визначали за Лакизою [108]. Відсоток абсолютно сухої речовини обчислювали за такою формулою:
А=б·100:в,
де А - відсоток абсолютно сухої речовини;
б - маса наважки після висушування, г;
в - маса наважки до висушування, г;
100 - коефіцієнт перерахунку, %.
Дослідивши відсоток сухої речовини в наважці, обчислювали процент води (100-А) і робили висновок про вміст сухої речовини в дослідних рослинах.
Визначення протеїну проводилось за І.К. Цитовичем [109].
Наважку 0,5-2 г подрібненого повітряно-сухого матеріалу, взяту на аналітичних вагах, переносили в колбу для спалювання (колбу Кьельдаля), доливали 25-30 мл концентрованої H2SO4, додавали 0,5 г CuSО4·5H2O в якості каталізатора. Визначали вміст азоту за Кьельдалем. Паралельно визначали вологість досліджуваного рослинного матеріалу. Вміст "сирого" протеїну (х) в процентах вираховували за формулою:
х=,
де а - об'єм взятої 0,1 н. H2SO4 (мл);
К1 - поправка до титру 0,1 н. розчину H2SO4;
б - об'єм 0,1 н. розчину лугу (мл);
К2 - поправка до титру лугу;
Н - наважка речовини, взятої для аналізу.
Для перерахунку на абсолютно суху речовину знайдений результат множили на - де у - вміст гігроскопічної вологи (%).
Кількісне визначення загального, розчинного і білкового азоту проводили в сухому матеріалі, оскільки сухий матеріал не так сильно піниться при спалюванні. Спінювання відбувається тоді, коли в тканинах рослин є багато цукрів.
Визначення кількості загального азоту [107].
Наважку сухого матеріалу 0,2-0,5 г насипали в суху колбу Кельдаля. Доливаємо 5 мл сірчаної кислоти (питома вага 1,84), закривали її спеціальною пробкою і ставили на електроплитку або на піщану баню, під яку підведено газові горілки. Спалювання матеріалу потрібно проводили під витяжкою, тому що при цьому, крім аміаку утворюються і інші гази, зокрема шкідливі й задушливі окиси азоту та сірки.
Цей розчин використовували для проведення реакції з реактивом Неслера. Після додавання реактиву Неслера рідина в колбі набувала жовтого забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості азоту в матеріалі. Розчин колориметрували на фотоколориметрі з синім світофільтром порівнюючи з контролем.
Визначення клітковини проводили за A.I. Єрмаковим [110].
Для визначення клітковини використовували висушений досліджуваний матеріал, подрібнювали його, просіювали через сито. Наважку переносили у центрифужну пробірку і приливали суміш оцтової і азотної кислоти, центрифугували.
До отриманого розчину, добавляли 5 крапель 0,2% розчину фенілантранілової кислоти, який титрували 0,1н. розчином тіосульфату до переходу вишневого забарвлення в зелене. Окремо титрували 10 мл 0,5 н. розчину біхромату калію, розбавивши його 15 мл дистильованої води.
визначення вмісту клітковини проводили за формулою:
х =
х =
де К - нормальність титрованого розчину тіосульфату;
а - об'єм тіосульфату, затраченого при контрольному титруванні 10 мл біхромату (мл);
b - об'єм тіосульфату, затраченого для визначення клітковини (мл);
n - наважка досліджуваного матеріалу ( г);
0,675 - нормальний титр клітковини, помножений на 100.
Визначення каротину проводили за А.І. Єрмаковим [110]. Рослинний матеріал розтирали з Na2CO3, добавляючи ацетон. Далі вміст ступки фільтрували під вакуумом. Бензиновий розчин при слабому відсмоктуванні пропускали через хроматографічну колонку (Аl2О3). Потім пропускали чистий бензин, хроматографували до зникнення жовтого забарвлення витікаючого елюата. Бензиновий розчин каротину переносили у мірну колбу об'ємом 100 мл і доводили бензином до мітки.
Вміст каротиноїдів визначали за формулою:
х =
де К - кількість