РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Рослинний матеріал
Калусна тканина. Досліди проводили з культурою клітин томату (Lycopersicon esculentum). Калусна культура клітин томату була люб'язно надана нам д-ром Т. Боллером (Щвейцарія).
Калусну тканину вирощували на агаризованому поживному середовищі Т+ (табл. 2.1), що містить такі фітогормони: БАП - 0,6 мг/л та НУК - 3 мг/л. Рост та розвиток калусної культури клітин томату складав 28 - 30 діб.
Таблиця 2.1
Склад поживного середовища Т+
Речовина г/лMgSO4 х 7H2O 0,37KNO3 1,9NH4NO3 1,65NaH2PO4 х H2O 0,17CaCL2 х 2H2O 0,44MnSO4 х H2O 0,16ZnSO4 х 7H2O 0,08CuSO4 х 5H2O 0,02KJ 0,008H3BO3 0,062Na2MoO4 х 2H2O 0,025FeSO4 х 7H2O 0,278Na2 EDTA х 2H2O 0,372Сахароза 30 Тіамін- 2НCL 0,5 Продовження табл. 2.1
Нікотинамід 0,25 Кальцію D (+) пантотенат 0,25 Холінхлорид 0,125 Піридоксин-HCl 0,125 p-Амінобензоат 0,0025 Біотин (Віт. H) 0,0025 Ціанокобаламін (Віт. B12) 0,0025 рH 5.5
Суспензійна культура. Для отримання суспензійної культури клітин томату брали 10-12-денні клітини калусної тканини і культивували їх у рідкому поживному середовищі Т+ з тією ж комбінацією фітогормонів, що і для калусної тканини. Тривалість культивування клітин у суспензії протягом пасажу складала 13-15 діб. Лог-фаза тривала з 2-ої до 9-ої доби. Клітини інкубували на ротаційному шейкері (60 кол./хв) при 25°С в темряві. Перед використанням у подальших експериментах суспензію клітин культивували протягом двох-трьох пасажів. Пересадку здійснювали через кожні 4-6 діб.
Культура протопластів. Протопласти отримували з клітин 5-ти денної суспензійної культури. За сприяння співробітників відділу генетичної інженерії ІКБГІ НАНУ нами була підібрана ферментна суміш для виділення протопластів із суспензії клітин томату (табл. 2.2).
До 10 мл цієї суміші додавали 1 г клітин п'ятиденної суспензійної культури та інкубували при 25°С в темряві протягом 18 годин.
Клітини осаджували центрифугуванням (200g) протягом 5 хв. Супернатант обережно відбирали пастерівською піпеткою. До клітин додавали 5 мл 0,5 М розчину сахарози (рН 5,0). На розчин сахарози нашаровували 1 мл WSZ буфера (рН 4,8) для завантаження флуоресцентного зонду.
Таблиця 2.2
Ферментна суміш для отримання протопластів томату
РЕАГЕНТКОНЦЕНТРАЦІЯЦелюлаза (Onozuka R-10)0,5 %Мацерозим R-100,5 %Дрицелаза R-100,25 %Целюлізін R-100,25 %Пектоліаза Y-230,25 %Манітол0,5 MГліцин0,1MMgCl20,005 MCaСl20,0001 M рН 5,1
Склад WSZ буфера наведений у таблиці 2.3. Протопласти флотували центрифугуванням (200g) протягом 5 хв. Потім обережно відбирали ланцюжок протопластів і поміщали їх у пробірку.
Таблиця 2.3
Склад буферного середовища WSZ
Сахароза0,2 ММанітол0,5 ММgCl20,005 МKCl0,001 МДиметилглутарова к-та0,015 М *pH 4,6 - 5,4 (рівень рН буферного середовища залежав від маніпуляцій, які проводили з протопластами в конкретний момент).
В подальшому протопласти томату завантажували фуоресцентним зондом Iндо-1.
2.2. Еліситори
Для індукції захисних реакцій в суспензійній культурі клітин томату в якості еліситорів використовували олігомери хітину (N-ацетилглюкозамін) з різною довжиною ланцюгу від 2 до 5 ацетилглюкозамінних залишків (Хт2-, Хт3-, Хт4-, Хт5-), люб'язно надані нам д-ром Т. Боллером (Швейцарія), та хітозан (деацитильований хітин), що готувався нами за методикою Каусса [101].
Фрагменти хітину розчиняли в стерильній дистильованій воді та зберігали при -18 °С.
2.3. Індукція хітиназної активності
Для індукції хітиназної активності використовували 200 мкл еліситора, який додавали до 20 мл суспензійної культури клітин томату. Суміш розділяли на дві частини по 10 мл та поміщали у діалізні трубки об'ємом 25 мл. Ті ж маніпуляції проводили з клітинами контролю, але без додавання еліситору. Суспензію інкубували на ротаційному шейкері (60 об/хв) при 25°С у темряві за модифікованим нами методом протягом 25 год.
До першої частини клітин додавали субстрат для хітинази - іН-хітин. Для діалізу розщеплених фрагментів субстрату, які утворюються внаслідок ферментативної реакції, герметично зачинені діалізні трубки поміщали в колби з 50 мл середовища Т+. Для визначення динаміки індукції збільшення хітиназної активності через певні проміжки часу (2-25 год) з колб відбирали 2 мл діалізної рідини. Розщеплений рослинними хітиназами субстрат - іН-хітин, який знаходився в діалізній рідині, розчиняли в 18 мл сентиляційної рідини ЖС -8. Визначали відносні одиниці активності (CPM) фрагментів іН-хітину за допомогою радіометра Rack-Betta (Німеччина).
У другої частини клітин через ті ж проміжки часу (2-25 год) з діалізних трубок відбирали по 200 мкл суміші. В якості субстрату додавали таку ж кількість неміченого хітину. Вміст білка визначали за методом Лоурі [15].
В подальшому проводили перерахунок аліквотних кількостей, враховували похибку при відборі проб з діалізної рідини та виражали кінцеву хітиназну активність в CPM/мг білка.
2.4. Індукція накопичення калози
2.4.1. Флуоресцентна мікроскопія
Відкладання калози в клітинах томату спостерігали за допомогою флуоресцентної мікроскопії при фарбуванні аніліновим блакитним. Розчин анілінового блакитного 0,1 %-ної концентрації (в/о) готували в 1М гліцин/NaOH буфері (рН 9,5). До суспензiї клітин томату розчин барвника додавали безпосередньо на мікроскопічному склі. Клітини попередньо адгезували на склі за допомогою 0,01%-ного розчину полі-L-лізину. Для цього на скляні пластинки наносили по 10 мкл розчину полі-L-лізину. Пластинки витримували у вологій камері протягом 1-1,