РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Характеристика реактивів
У роботі використовували такі реактиви:
Агароза Sigma, США
БАП (6 – бензиламінопурин) Duchefa, Нідерланди
5-бромо-4-хлоро-3-індоліл-b-D-глюкуронідаза Sigma, США
2,4 – Д (2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота) Serva, США
Дезоксинуклеотидтрифосфати Phormaceae, Швеція
Зеатин Duchefa, Нідерланди
Легкоплавка агароза Duchefa, Нідерланди
Маркер молекулярної ваги GibcoBRL
НОК (нафтилоцтова кислота) Duchefa, Нідерланди
Поліетиленгліколь 4000 Duchefa, Нідерланди
Спектиноміцин Duchefa, Нідерланди
Стрептоміцин Duchefa, Нідерланди
Тріс-ОН Sigma, США
Cellulase Onozuka R-10 Duchefa, Нідерланди
Cellulisin Sigma, США
Macerosim R-10 Duchefa, Нідерланди
Taq-полімераза Promega
Triton X-100 Sigma, США
Для приготування живильних середовищ та розчинів використовували солі та цукри,
вітаміни та амінокислоти вітчизняного виробництва зі ступенем очищення “осч”.
2.2. Рослинний матеріал
Цибридні рослини Nicotiana tabacum (+ Scopolia carniolica), Nicotiana tabacum
(+ Physochlaine officinalis), Nicotiana tabacum (+ Lycium barbarum) [45] та
Nicotiana tabacum (+ Atropa belladonna) [128] були отримані раніше в Інституті
клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ. Асептичні рослини Salpiglossis
sinuata, Lycium barbarum та Nicotiana tabacum зберігаються в колекції ІКБГІ
НАНУ.
Цибридна рослина Nicotiana tabacum (+ Salpiglossis sinuata) отримана N.D. Than
et al., 1988 [81] та люб’язно надана проф. Медееши (Сегедский Біологічний
центр, Угорщина).
Усі рослини вирощували в стерильних умовах при 16-годинному світловому дні на
безгормональному середовищі МS [129], розмножували живцюванням. Для
експериментів використовували рослини 3 - 5 тижневого віку.
2.3. Векторні конструкції та бактеріальні штами
Плазмідні векторні конструкції pCB033 та pICF584 були люб’язно надані проф.
H.-U. Koop (Інститут Ботаніки, Мюнхенський Університет, Німеччина). Для
ампліфікації плазмід використовували клітини Escherichia coli, штам XL-Blue.
Для відбору бактерій плазміди несуть ген стійкості до ампіциліну.
Плазміда pCB033 містить ген aadA (аміноглікозид 3`-аденілінтрансфераза), що
знаходиться під контролем промотору 16S рДНК тютюну та має термінатор гена rbc
(велика субодиниця рибулозо-1,5-бісфосфат-карбоксилази) з пластому
Chlamydomonas reinhardii. Селективний ген оточений генами rpl32 (рибосомальний
білок) і trnL (тРНК лейцину) малої унікальної ділянки тютюнового пластому, що
забезпечує вбудовування гена aadA у визначену ділянку хлоропластного геному
(рис. 2.1.).
Рис. 2.1. Схематичне зображення ділянки векторної плазміди рСВ033. Червоним
кольором показано селективний ген aadA (аміноглікозид3`-аденілінтрансфераза),
зеленим кольором - послідовності хлДНК (ndhF – ген субодиниці
НАДН-дегідрогенази, rpl32 - рибосомальний білок, trnL – транспортна РНК
лейцину). Білим кольором позначена хлДНК, що не входить в конструкцію. Чорними
стрілками вказані положення праймерів 1, 2, 3 і 4 (див. таблиці 2.4 та 2.5.).
Плазміда pICF584 містить, крім селективного гена aadA, репортерний ген uidA.
Гени знаходяться між послідовностями psbA (D1 білок фотосистеми ІІ) і trnH
(тРНК гістидіну) великої унікальної області пластома тютюну (рис. 2.2.).
Рис. 2.2. Схематичне зображення ділянки векторної плазміди рІСF584. Червоним
кольором показано селективний та репортерний гени (aadA - аміноглікозид3`-
аденілінтрансфераза, uidA – ген b-глюкуронідази), зеленим кольором -
послідовності хлДНК (psbA - D1 білок фотосистеми ІІ, trnH - транспортна РНК
гістидину). Білим кольором позначена хлДНК, що не входить в конструкцію.
Чорними стрілками вказані положення праймерів 5 і 6 (див. таблиці 2.4. та
2.5.).
2.4. Виділення і культивування протопластів
2.4.1. Ферментація.
У всіх експериментах використовували протопласти тканин листка. Листя, нарізане
на 1 - 2 мм смужки перпендикулярно серединній жилці, поміщали на поверхню
ферментного розчину, налитого в чашку Петрі, і інкубували протягом 12-16 годин
у темряві при кімнатній температурі. Склад ферментних розчинів, що
використовувався для кожного з видів, наведений у таблиці 2.1. Ферментні
розчини стерилізували фільтруванням через мембранні фільтри Millipore (США) з
розміром пор 0,22 мкм.
Таблиця 2.1.
Склад ферментних розчинів для отримання мезофільних протопластів.
Компонент
розчину
Тютюн та цибриди з ядром тютюну
S. sinuata
L. barbarum
Cellulase
Onozuka R-10
0,7%
0,35%
0,6%
Macerosim R-10
0,2%
0,1%
0,6%
Cellulisin
0,2%
манітол
0,5 М
0,5 М
сахароза
0,4 М
CaCl2
10 мМ
10 мМ
10 мМ
гліцин
0,1 M
Необхідно зазначити, що рослини, в залежності від їх віку, фізіологічного стану
та умов вирощування можуть мати різну чутливість до ферментів. Наприклад,
рослини молодшого віку необхідно ферментувати в менш концентрованих розчинах.
Тому, виходячи з конкретних умов експерименту, іноді використовували в 1,5 раза
більшу або в 1,5 - 2 рази меншу концентрацію ферментів, ніж у наведених в
таблиці 2.1 розчинах.
2.4.2. Відмивка та виділення фракції живих протопластів.
Протопласти відділяли від залишків тканин листя за допомогою фільтрування через
нейлоновий фільтр (діаметр пор – 100 - 150 мкм). Осаджували центрифугуванням
при 100 - 120 g протягом 7 хвилин. Осад ресуспендували пастерівською піпеткою в
0,5 M розчині сахарози. Зверху нашаровували 2 мл розчину W5 [130].
Центрифугували 10 - 15 хвилин при 150 - 190 g. Живі протопласти, що утворювали
шар між розчинами сахарози і W5, збирали пастерівською піпеткою і переносили до
нових центрифужних пробірок. Отриману фракцію живих протопластів ресуспендували
або в трансфор