РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти дослідження
Об'єктами дослідження були:
* штам Streptomyces avermitilis (штам 1313), виділений з чорноземного ґрунту Житомирської області Попельнянського району співробітниками відділу загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології НАН України та депонований в Українській колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України під номером УКМ Ac-2161 [71] та його продуктивні варіанти 288 (УКМ Ас-2172) та 1088 (УКМ Ас-2177),
* мікробні угруповання чорнозему та сірого опідзоленого ґрунту;
Дослід закладено на лучно-чорноземному вилугуваному грубопилувато-легкосуглинковому ґрунті на лесовидному суглинку, відібраний в Хмельницькій обл., Городоцького району, с. Кремінна. Гранулометричний ґрунт однорідний по профілю. Ґрунт гумусовий, темно-сірий, вологий, крупнопильний важкосуглинистий; загальний вміст гумусу в основному шарі становив 3,2-3,9%, реакція ґрунтового розчину слабко-кисла; в орному шарі рН ґрунту від 6,0 до 8,0.
Темно-сірий опідзолений крупно пилуватий легкосуглинковий ґрунт на лесовидному суглинку був відібраний у м. Києві. Загальний вміст гумусу в основному шарі становив 1.80-2,10%, містить SiO2; рН ґрунту в орному шарі від 4,3 до 4,8.
* галової нематоди виду Meloidogyne incognito, виділеної з коріння огірків;
* огірки сортів "Конкурент" та "Анжеліна" (гібрид F1).
2.2. Культивування Streptomyces avermitilis
Гетерогенність культури перевіряли на 13-ти синтетичних та органічних агаризованих середовищах за схемою, яка була запропонована В.Д. Кузнєцовим [45]. Склад середовищ наведений в таблиці 2.1. На чашки Петрі, що містять по 10 мл кожного з поживних середовищ, наносили по 0,1 мл спорової суспензії 1·105 і 1·106 розведень та інкубували протягом 10-ти діб при температурі 28°С. Проводили аналіз утворених морфологічних варіантів.
Таблиця 2.1.
Середовища для проведення популяційного аналізу
СередовищеСклад середовища (г/л)рН Посилання1234Красильникова (СР-1)сахароза - 20;
MgSO4 - 0,5;
NaCl - 0,5;
KNO3 - 1;
K2HPO4 - 0,5;
CaCO3 - 3;
агар-агар - 20 7,0?39?
ІSР-3
(вівсяний агар з мікроелементами)вівсяні пластівці - 20;
глюкоза - 20;
CaCO3 - 0,2;
сольовий розчин №1* - 1 мл;
агар-агар - 207,27?183?
Глюкозо- картопляний агар (ГКА)відвар 200 г картоплі;
глюкоза - 20;
CaCO3 - 3;
MgSO4 - 0,2;
агар-агар - 20 7?190?
Продовження таблиці 2.1.
1234Пептоно-дріжджовий агар з залізом
(ПДА-Fe)пептон - 10;
дріжджовий екстракт - 1; цитрат Fe - 0,5;
агар-агар - 20 7,0-7,2?183?
Органічний агар 2 (Гаузе 2)бульйон Хоттінгера - 30 мл; пептон - 5;
NaCl - 5;
глюкоза - 10;
агар-агар - 20 7,0-7,2?10?
Гліцерин-нітратний агар (середовище Лінденбейна)гліцерин - 30 (24 мл);
NaNO3 - 2;
K2HPO4 - 1;
MgSO4 - 0,5;
КCl - 0,5;
FeSO4 - 0,01;
агар-агар - 20 7,2?125?
ІSР-5 (гліцериново-аспарагіновий агар)аспарагін - 1;
гліцерин - 10 (8 мл);
K2HPO4 - 1;
сольовий розчин № 1*- 1 мл; агар-агар - 20 7,0-7,4?183?
Глюкозо-аспарагіновий агар КраінськогоL-аспарагін - 0,5;
глюкоза - 10;
K2HPO4 - 0,5;
агар-агар - 207,0?45?
Продовження таблиці 2.1.
1234
Крохмало-аміачний агар (ІSР-4)крохмаль розчинний - 10;
K2HPO4 - 1;
MgSO4 - 1;
NaCl - 1;
(NH4)2SO4 - 2;
CaCO3 - 2;
сольовий розчин №1* -1 мл; агар-агар - 20 7,0-7,4?45, 183?
Сахарозо - нітратний агар Чапекасахароза - 30;
NaNO3 - 2;
K2HPO4 - 1;
MgSO4·7Н2О - 0,5;
КCl - 0,5;
FeSO4 - 0,001;
агар-агар - 20 7,0-7,3?190?
Мінеральний агар 1 (Гаузе 1)крохмаль розчинний - 20;
K2HPO4 - 0,5;
MgSO4 - 0,5;
KNO3 - 1;
NaCl - 0,5;
FeSO4 - 0,01;
агар-агар - 207,2-7,4?10?
Продовження таблиці 2.1.
1234Соєвий агарсоєве борошно - 20;
глюкоза - 10;
NaCl - 5;
агар-агар - 206,9?39?
Агар Чапека з глюкозою і кукурудзяним екстрактомкукурудзяний екстракт - 20;
глюкоза - 2;
K2HPO4 - 1;
MgSO4·7Н2О - 0,5;
КCl - 0,5;
FeSO4·7Н2О - 0,01;
CaCO3 - 5;
агар-агар - 20 7,0-7,3?39?* - сольовий розчин №1 (дист. вода - 100 мл; FeSO4 - 100 мг; MgCl2 - 100 мг; ZnSO4 - 100 мг)
Для того, щоб виявити максимальні потенційні можливості синтезу авермектинового комплексу селекціонованими варіантами S. avermitilis, їх культивували на середовищах, що нині використовуються у виробництві. Склад середовищ, що використовували наведені в таблиці 2.2.
Як посівний матеріал використовували штам S. avermitilis, вирощений у середовищі ССм впродовж однієї доби на ротаційній качалці (n = 240 об/хв) при 28оС. Посівний матеріал брали у кількості 5%. Культивування проводили в колбах об'ємом 750 мл в умовах постійного обертання на ротаційній качалці (n = 240 об/хв) при 28оС.
Таблиця 2.2.
Рідкі середовища для вирощування Streptomyces avermitilis
№Склад середовища (г/л)Посилання123Соєве середовище
(ССм)Соєве борошно - 15;
Сухі дріжджі - 5;
Глюкоза - 2071Соєве середовище
(СС10)Соєве борошно - 16;
Сухі дріжджі - 4;
Кукурудзяний екстракт - 4,8 мл;
CaCO3 - 4;
K2HPO4 - 1;
Крохмаль - 23;
Глюкоза - 70модифіковане нами
Соєве середовище
(СС11)Соєве борошно - 12;
Сухі дріжджі - 6;
CaCO3 - 6;
Кукурудзяний екстракт - 3;
Глюкоза - 3097Соєве середовище (СС12)Соєве борошно - 14;
Дріжджовий екстракт - 2,5;
NaCl - 1;
Глюкоза - 45116
Соєве середовище (СС13)Соєве борошно - 12;
Сухі дріжджі - 5;
Кукурудзяний екстракт - 3;
CaCO3 - 4,5;
K2HPO4 - 0,5;
Глюкоза - 6068
Продовження таблиці 2.2.
123Картопляне середовище (СС14)відвар 200 г картоплі в 1 л води;
CaCO3 - 3;
MgSO4 - 0,2;
глюкоза - 20Модифіковане намиСоєве середовище (СС15)Соєве борошно - 12;
Дріжджовий автолізат - 4;
Кукурудзяний екстракт - 3;
CaCO3 - 4,5;
K2HPO4 - 0,5;
Глюкоза - 50 71
Підбір оптимальної концентрації глюкози проводили шляхом культивування S. avermitilis варіанту 1088 на середовищі СС10. Змінювали концентрації глюкози