РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Джерела виділення бактерій
Для виділення бактерій використовували зразки ґрунтів та листя рослин. Зразки дерново-підзолистих радіоактивних ґрунтів із 10-км зони ЧАЕС та контрольних ґрунтів люб'язно було передано нам д.б.н., професором Н.Н. Ждановою (Інститут мікробіології і вірусології НАН України, відділ фізіології та систематики мікроміцетів). Відбір зразків проводився у 1994-1996 рр. три рази на рік із семи постійних пунктів спостереження, які розташовані на околицях міста Прип'ять і сіл Чистогалівка, Копачі, Ново-Шепеличі (всі в межах 10 км зони ЧАЕС, рис 2.1, наведено за [3]). Контрольні зразки ґрунтів було відібрано за межами забруднених радіонуклідами територій в екосистемах з подібними кліматом, геологічними характеристиками і типом ґрунту (північнозахідні околиці м. Києва).
Радіоактивність зразків ґрунту визначалась у відділі радіоелементного аналізу Інституту ядерних досліджень НАН України на ?-спектрометрі фірми "Nokia" [2].
Рослинні зразки (листя дуба, тополі, берези, акації, горобини) із зони відчуження ЧАЕС було одержано нами з експедиції Інституту зоології НАН України. Контрольні рослинні зразки відбирали за межами забруднених радіонуклідами територій.
2.2. Об'єкти досліджень
Дослідження проводили з 64 штамами різних видів Methylobacterium, Bacillus, Pseudomonas, актинобактерій (нокардієформи та корінеформи) та ін., які було ізольовано нами із ґрунтів і філосфери рослин 10-км зони ЧАЕС та з контрольних ґрунтів (табл. 3.3, див. розд. 3.1). Серед них найбільш широко було представлено Methylobacterium extorquens - 14 штамів, M. мesophilicum - 4, Bacillus cereus - 8, інші види бактерій представлено поодинокими штамами.
Як референтні використовували штами, одержані з Української колекції мікроорганізмів, які було ізольовано поза межами зони ЧАЕС, тобто із регіонів України незабруднених радіонуклідами (Одеська, Харківська, Волинська, Київська області) [161]. Штам Methylobacterium мesophilicum 4181 одержано з АТСС, штам Pseudomonas putida BS228 - з колекції інституту генетики РАН (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Штами бактерій, які було використано як референтні
ВидШтамЗвідки штам було одержаноMethylobacterium ЛКЛУкраїнська колекція мікрорганізмівextorquensВ8Те самеВ121Те самеX4Те саме9-007Те самеС62Те самеM. mesophilicumП93Українська колекція мікрорганізмів4181АТСС (АТСС 29983)Pseudomonas putidaBS 228Колекція Інституту генетики РАНBacillus subtilis28-95Українська колекція мікрорганізмів1820Те самеBacillus cereus44Те самеB. megaterium69Те самеB. liheniformus5126Те саме
Примітка. АТСС - American Type Culture Collection, Rockville, Md.,USA.
2.3. Поживні середовища для культивування бактерій
Хемоорганотрофні бактерії вирощували на рідкому середовищі ММ (г/л): Na2НРО4 ? 12Н2О - 7,24; КН2РО4 - 3,54; (NH4)2SO4 - 0,6; MgSO4 ?? 7H2O - 0,4; CaCl2 ? 2H2O - 0,1; FeSO4 ? 7H2O - 0,01; вода - 1л; рН 6,8-7,0 [161]. За необхідності у середовище додавали 2% агару (середовище ММА). Як єдине джерело вуглецевого живлення при вирощуванні штамів Methylobacterium використовували метанол (0,5 об.%), для інших гетеротрофних бактерій - глюкозу (0,5 %). Для пригнічення росту грибів у середовище вносили ністатин у кількості 50 мг/л. Культивування хемоорганотрофних бактерій проводили також на агаризованому глюкозо-картопляному середовищі (ГКА), та агаризованому м'ясо-пептонному бульйоні (МПА).
2.4. Визначення чисельності бактерій у природних зразках
Кількість бактерій в дослідах визначали методом розсіву десятикратних послідовних розведень бактеріальної суспензії на агаризовані середовища [162, 163]. Після інкубації в термостаті при 30?С підраховували кількість колонієутворюючих одиниць (КУО/мл).
Аеробні хемоорганотрофні бактерії. Для виявлення якісної різноманітності аеробних хемоорганотрофних бактерій облік колоній проводили диференційовано протягом семи діб культивування в тих чашках Петрі, де загальна кількість колоній не перевищувала 50. Основним критерієм для визначення різних морфотипів колоній слугувала сукупність їхніх властивостей: наявність пігментації, утворення воднорозчинного пігменту та позаклітинного слизистого матеріалу, консистенція, розмір тощо.
Метаноласимілюючі бактерії. Кількість цих бактерій визначали на ММА із 0,5 об.% метанолу, як єдинного джерела вуглецю й енергії. Облік проводили на 3-7 добу росту.
Азотфіксуючі бактерії. Наявність азотфіксаторів установлювали на агаризованому безазотному середовищі Ешбі [163]. Облік проводили на 10-15 добу росту.
Нітрифікуючі бактерії. Кількість цих бактерій визначали на рідкому середовищі Виноградського, яке містило 0,5 г/л (NH4)2SO4 [163]. Облік проводили на 20-25 добу. Про наявність нітриту в середовищі свідчила поява червоного забарвлення в результаті дії реактиву Гриса.
Залізовідновлюючі бактерії. Кількість залізобактерій визначали в аеробних умовах на рідкому середовищі Калиненка [163], яке містить лимоннокисле залізо (1г/л). Облік проводили на п'яту добу. Зникнення забарвлення та утворення бурого осаду свідчило про наявність бактерій, які відновлюють залізо.
Сульфатредукуючі бактерії. Сульфатредукуючі бактерії виявляли на середовищі Постгейта "В" в анаеробних умовах [163]. Для цього в біологічні пробірки вносили по 0,5 мл кожного розведення ґрунтової суспензії і до нижньої поверхні гумового корка додавали середовище Постгейта "В". Облік проводили на 7-14 добу. Виникнення чорного забарвлення середовища внаслідок утворення сульфіду заліза свідчило про наявність процесу сульфатредукції.
Целюлозоруйнуючі бактерії. Кількість бактерій визначали на рідкому середовищі Гетчинсона у біологічних пробірках зі смужкою фільтрувального паперу Ватман №1 (рН 7,2-7,3) [163]. У середовище вносили дріжджовий екстракт (0,1 г/л). Облік досліду проводили на 30 добу. Про наявність целюлозоруйнуючих бактерій свідчив лізис целюлози і поява жовтувато