РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Реактиви
У роботі були використані такі реагенти та матеріали: HEPES, трис - НСl, АТФ, середовище RPMI 1640, ?-токоферол, Хехст 33342, пропідію йодид (Sigma, CША), тритон Х-100, Кумасі G-250 (Ferak, Німеччина), EДTA, EГTA ( SERVA, США ), креатинфосфат, креатинкіназа, акриламід, ТЕМЕД, персульфат амонію, гліцин, додецилсульфат натрію, N?,N?-метилен-бісакриламід (Reanal, Угорщина).
Інші реактиви (сахароза, дифеніламіновий реактив, ацетальдегід, хлорид кальцію, лимоннокислий натрій, пероксид водню, ембріональна теляча сироватка та інші) вітчизняного виробництва кваліфікації хч та охч.
2.2. Виділення тимоцитів щурів
Досліди проводили на щурах лінії Вістар обох статей вагою 120 - 150 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію.
Після декапітації тварини проводили розтин грудної порожнини, обережно, щоб не пошкодити кровоносні судини, вилучали тимус та поміщали його у буфер такого складу (мМ): Na2HPO4 - 3, KCl - 5, NaCl - 120, CaCl2 - 1, глюкоза - 10, MgSO4 - 1, NaHCO3 - 4, HEPES - 10, рН 7,4. Тимус (200 - 300 мг) відділяли від сполучної тканини та кровоносних судин і перетирали через чотири шари нейлонової сітки у буфері для виділення. Загальний об'єм доводили до 10 мл. Отриману суспензію клітин відмивали (1000 g, 10 хв) у тому ж буфері. Надосадову рідину зливали, а осад ресуспендували до концентрації 2-5 x 108 кл/мл. Кількість тимоцитів підраховували за допомогою світлового мікроскопу Biolam "ЛОМО" Р12 у камері Горяєва з використанням 0,4 % розчину трипанового синього. Вихід тимоцитів у середньому складав 10 х 108 кл/г тимусу.
2.3. Умови постановки експерименту
Інкубацію клітин (2-4 х 106 кл/мл) здійснювали протягом 1 та 3 год у термостаті при 37оС у середовищі RPMI 1640 з додаванням 8 мМ NaHCO3, 20 мМ HEPES та 5% ембріональної телячої сироватки.
У роботі було застосовано такі умови постановки експеримента:
1 - як контроль використовували суспензію інтактних клітин, які інкубували у середовищі вказаного складу;
2 - перед інкубацією клітинну суспензію піддавали однократному рентгенівському опроміненню у дозі 4,5 Гр. Опромінення клітинної суспензії здійснювали на установці РУМ-17 за таких умов: експозиційна доза - 11,61 х 10-2 Кл/кг, потужність дози - 0,24 Гр/хв, фільтри 0,5мм (Сu + Аl), напруга 200 кВ, сила струму 10 мА, фокусна відстань - 50 см;
3 - до середовища інкубації клітин додавали пероксид водню до кінцевої концентрації 0,1 мМ.
2.4. Оцінка вмісту життєздатних, некротичних та апоптичних клітин у суспензії
Для оцінки вмісту живих, некротичних та апоптичних клітин у суспензії застосовували метод подвійного прижиттєвого фарбування клітин флуоресцентними барвниками Хехст 33342 (1 мкг/мл) та пропідію йодид (0,04 мкг/мл) [19]. Клітини відмивали від середовища інкубації у буфері для виділення клітин, після чого додавали барвники та інкубували протягом 10 хв у темряві за кімнатної температури. Забарвлені клітини фіксували у темряві 5% забуференим розчином формаліну (рН 7,4), протягом 5 хв, та відмивали від формаліну буфером для виділення клітин (1000 g, 7 хв). Супернатант зливали, до осаду додавали 10 мкл того ж буферу. Аліквоту клітинної суспензії наносили на предметне скло, робили мазок та висушували у темряві. Морфологічну оцінку стану клітин проводили під люмінесцентним мікроскопом МЛ - 2 (Росія) при збільшенні 70. У кожному експерименті аналізували не менше 600 клітин.
Аналогічним чином із застосуванням барвника Хехст 33342 оцінювали морфологічний стан ізольованих ядер тимоцитів.
2.5. Отримання ядерної та мітохондріальної фракцій клітин
Суспензію клітин (108 клітин) гомогенізували у 10-кратному об'ємі буферу А (мМ): сахароза - 250, KCl - 50, КH2PO4 - 2,5, MgCl2 - 2, HEPES - 10 (pH 7,4) у щільно притертому скляному гомогенізаторі Поттера за підібраних нами умов, описаних у [7]. Отриману суспензію осаджували (1500g, 10 хв), надосадову (S1) використовували для отримання мітохондріальної фракції, як описано нижче, а осад (грубу ядерну фракцію) - для отримання ядерної фракції методом центрифугування у градієнті сахарози. Для цього осад ресуспендували у 7,5 мл буферу А та обережно перемішуючи, додавали 7,5 мл буфера Б (мМ): сахароза - 1500, МgCl2 - 3, КСl - 50, HEPES - 10, pH 7,4. Отриману суспензію нашаровували на 9 мл буферу Б та проводили центрифугування (15 000 g, 45 хв). Отриманий осад (очищена ядерна фракція) двічі відмивали за тих самих умов та ресуспендували у буфері А.
Процедуру отримання ядер проводили при t 0 +4о С у присутності інгібітора протеїназ фенілметилсульфанілфториду (0,1 мМ).
Відсутність у отриманому препараті ядер цитоплазматичних домішок перевіряли, здійснюючи аналіз під фазово-контрастним мікроскопом. Чистоту отриманих ядер перевіряли за співвідношенням білок : ДНК, яке становило 4,8 ( 0,2 для ядер. Цілісність ядер перевіряли, профарбовуючи мазки гематоксиліном. Підрахунок кількості ядер у отриманих препаратах проводили після профарбовування суспензії ядер вітальним барвником трипановим синім.
Надосадову (S1) центрифугували за умов: 15000 g, 10 хв при +4оС. Осад ресуспендували в 10 мл буферу А та центрифугували за тих же умов, процедуру повторювали двічі. Осад використовували як фракцію мітохондрій.
Надосадову (S2), що залишилася після осадження мітохондрій, центрифугували (15000 g, 20 хв) для отримання грубої розчинної фракції.
2.6. Виділення хроматину
Хроматин виділяли за методом [63]. Процедуру отримання хроматину проводили при t 0...+4о С в присутності інгібітора протеїназ фенілметилсульфанілфториду (0,1 мМ). Ядра (5 ?107) ресуспендували у 10 мл буфера, що містив (мМ): ЕДТА - 2, NaCl - 280, трис-НСl - 1 (рН 7,9) та 1% тритон Х-100, після чого центрифугували при 12000 g 10 хв. Отриманий осад ресуспендували у 10 мл буфера, що містив (мМ): ЕДТА - 2, трис-НСl - 1 (рН 7,9) та осаджували за тих же умов. Процедуру відмивки повторювали тричі. Отриманий