Глава 2
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект и условия эксперимента
В работе использовались крысы-самцы линии Wistar массой 150-180 г, содержавшиеся в стандартных условиях вивария Харьковского национального университета имени В.Н.Каразина. Эксперименты на животных проводили в соответствии с правилами "Европейской конвенции защиты позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях".
2.1.1. Моделирование оксидативного стресса
Соли тяжелых металлов - хлорид кобальта и хлорид ртути растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно в дозах, которые вызывают оксидативный стресс, а именно: СоСl2 * 6Н2О - 3 мг на 100 г массы [218], НgCl2 - 0,7 мг на 100 г массы [219].
Оксидативный стресс развивается, когда повреждающий агент вызывает гиперпродукцию активных метаболитов кислорода, которые сдвигают равновесие системы прооксиданты-антиоксиданты в сторону повышения содержания прооксидантов. При этом активируется свободнорадикальное окисление, в том числе и перекисное окисление липидов (ПОЛ). Многие продукты свободнорадикального окисления являются регуляторными молекулами и активируют системы антиоксидантной защиты и ферменты адаптации метаболизма.
Таким образом, оксидатавный стресс - это универсальная реакция организма, направленная на мобилизацию физиологических и биохимических регуляторных систем, которые обеспечивают защиту от необратимых повреждений и выживание организма в экстремальных условиях.
Настоящая работа посвящена изучению ряда показателей метаболизма углеводов, липидов и азотистого обмена в динамике после введения в организм солей кобальта или ртути.
2.2. Получение сыворотки крови, суспензии эритроцитов и приготовление гомогенатов тканей
Кровь собирали в сухие центрифужные пробирки, выдерживали 20 мин на льду и центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Сыворотку отбирали в отдельные пробирки и использовали в дальнейших определениях.
Для получения суспензии эритроцитов в пробирку с 7,5 мл рабочего раствора хлорида натрия (25 мл 1 М фосфатного буфера рН 7,4 смешивали с 25 мл раствора хлорида натрия 170 г/л, объем смеси доводили до 1 л и перед употреблением насыщали кислородом воздуха путем встряхивания) добавляли 0,1 мл крови, суспендировали эритроциты путем втягивания и выдувания жидкости с помощью пипетки. Центрифугировали взвесь 10 мин при 1000 об/мин, надосадочную жидкость осторожно отсасывали. К осадку эритроцитов добавляли 7,5 мл рабочего раствора хлорида натрия и вновь суспендировали эритроциты тем же способом [220].
Брюшную полость животного быстро вскрывали, печень перфузировали охлажденным физиологическим раствором. Из печени, почек и сердца готовили 2,5 % гомогенаты на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Полученные гомогенаты использовали для определения активности аланин- и аспартатаминотрансфераз. Для определения активности тирозинаминотрансферазы и аргиназы печень соответственно гомогенизировали в 0,02 М фосфатном буфере, приготовленном на 0,14 М КСl (рН 7,6) и в 0,075 М Na-глициновом буфере (рН 9,36). Полученные гомогенаты центрифугировали в рефрижераторной центрифуге ЦЛР-1 при 9000 g в течение 1 ч или 20 мин соответственно [221]. В супернатантах изучали активность ТАТ и аргиназы.
2.3. Получение субклеточных фракций
Печень крысы быстро охлаждали в среде гомогенизации: 0,25 М сахарозе, приготовленной на 0,05 М трис-НСl буфере (рН 7,4). Ткань обсушивали фильтровальной бумагой, тщательно измельчали ножницами. Навеску тканевой кашицы гомогенизировали с 4 объемами среды выделения. Гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин для удаления обломков клеток и ядер. Полученный супернатант сливали в стаканчик, стоящий во льду, а осадок вновь гомогенизировали в 2 объемах среды выделения, затем вновь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Осадок отбрасывали, а супернатанты объединяли и фильтровали через 4 слоя марли. Фильтрат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 мин. Все этапы центрифугирования проводили на рефрижераторной центрифуге ЦЛР-1. Полученный центрифугат - постмитохондриальная фракция. Осадок, представляющий собой митохондриальную фракцию, суспендировали в среде выделения, содержащей 50 мМ трис-НСl буфер (рН 7,4), 0,25 М сахарозу, 0,002 М цистеин и 1,5 мл глицерина, при непрерывном помешивании в течение 20 минут [222]. Постмитохондриальную и митохондриальную фракции использовали для определения активности аланин-, аспартат- и тирозинаминотрансфераз и содержания п-гидроксифенилпирувата.
2.4. Определение содержания гликогена в печени
Гликоген печени определяли методом Кемпа [223] и выражали в г на 100 г ткани.
2.5. Определение содержания свободных жирных кислот в сыворотке крови
Содержание свободных жирных кислот в сыворотке крови определяли методом Данкомба [224] и выражали в мг/мл.
2.6. Определение спонтанного гемолиза эритроцитов
Спонтанный гемолиз эритроцитов определяли по Ягеру [220]. Суспензию эритроцитов наливали по 1 мл в три центрифужные пробирки; в первые две пробирки прибавляли по 4 мл рабочего раствора хлорида натрия, а в третью - 4 мл дистиллированной воды (для полного гемолиза). Пробы перемешивали стеклянной палочкой и ставили на 2 ч в термостат при 380 С. По окончании инкубации содержимое пробирок перемешивали, центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин и измеряли экстинкцию всех проб против дистиллированной воды на спектрофотометре при 540 нм. Расчет проводили по формуле
х = (Е1 + Е2)100
2Е3
где х - степень гемолиза, %; Е1 и Е2 - экстинкции первой и второй проб; Е3 - экстинкция третьей пробы.
2.7. Определение активности тирозинаминотрансферазы
Активность тирозинаминотрансферазы определяли в печени спектрофотометрически при ? = 670 нм по накоплению п-гидроксифенилпирувата в инкубированных пробах, измеряя эк
- Київ+380960830922