РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи досліджень
2.1. Матеріали досліджень
Організація та мінливість рДНК вивчалась у ліній та гiбридних форм виду Zea
mays L.: УЧ-24, Wx Sd5, л. 101, л. 102, л. 105, л. 107, л. 346, л. 502, гібриди
Г-0, Г-1, Г-2, Г-5, Г-7, “Пiонер”; культурних сортiв виду Narcissus x hybridus
hort.: Голден Харвест (Golden Harwest), Бiршеба (Beersheba), Вiкторiя бiколор
(Victoria bicolor), Смарагд (Smaragd), Бiнкi (Bincie), Актеа (Actaea) і диких
видiв роду Narcissus L.: N. tazetta L. i N. angustifolius Curt.; та 12 видів
роду Nicotiana L., що належать до різних підродів.
Генетичнi зв’язки мiж дослiдженими формами кукурудзи наведенi на рис. 2.1.
лінія УЧ-24 х лінія Wx Sd5 лінія 346 х лінія 502
гібрид х лінії 101, 102, 105, 107 гібрид
Г-0 “Піонер”
гібриди
Г-1, Г-2, Г-5, Г-7
Рис. 2.1. Генетичні зв’язки між дослідженими формами кукурудзи.
Перелік досліджених видів роду Nicotiana наведений в табл. 2.1.
Насіння кукурудзи обробляли 1% розчином KMnO4, гідратували 14-16 год. та
пророщували в термостаті при температурі 28°С на дистильованій воді протягом
трьох-чотирьох діб. Етиольовані паростки задовжки 2-3 см зрізали і виділяли з
них сумарну ДНК.
Таблиця 2.1
Перелiк дослiджених видiв роду Nicotiana
Вид
Походження матерiалу
Підрід Petunioides (Don) Goodsp.
Секція Trigonophyllae Goodsp.
N. trigonophylla Dunal
Секція Repandae Goodsp.
N. repanda Willd.
Секція Noctiflorae Goodsp.
N. noctiflora Hooker.
Секція Nudicaules Goodsp.
N. nudicaulis S.Watson
Секція Suaveolentes Goodsp.
N. suaveolens Lehm.
N. excelsior J.M.Black
N. megalosiphon Van Huerck & Mьll.Arg.
N. debneyi Domin
N. africana Merxm.
БСН
ГБГ
ГБГ
ГБГ
ГБГ
БСН
ГБГ
БСН
БСН
Підрід Rustica (Don) Goodsp.
Секція Paniculatae Goodsp.
N. knigtiana Goodsp.
N. paniculata L.
N. solanifolia Walp.
БСВ
БСЛ
БГД
Примiтка.
БСН – Ботанiчний сад університету м. Ніймеген, Нідерланди; ГБГ – Генетичний
банк Інституту генетики рослин та дослідження культурних рослин, м.
Гатерслебен, Німеччина; БСВ – Ботанічний сад м. Варшава, Польща; БСЛ –
Ботанічний сад м. Лейпціг, Німеччина; БГД – Ботанічний сад м. Дебрецен,
Угорщина.
Рослини досліджених сортів і видів нарцисів були вирощені у відкритому грунті в
Ботанічному саду Чернівецького державного університету ім. Ю. Федьковича. Для
виділення сумарної ДНК використовували квіти у фазі цвітіння.
Рослини досліджених видів тютюнів були вирощені в оранжереї Чернівецького
державного університету ім. Ю. Федьковича протягом 3-4 місяців з насіння,
отриманого з колекцій різних ботанічних садів (див. табл. 2.1). Для виділення
сумарної ДНК використовували верхні листки рослин у фазі цвітіння.
2.2. Методи досліджень
В роботі використовувались хімічні речовини вітчизняного та зарубіжного
виробництва класу чистоти “ч.д.а.” та “х.ч.”
В и д i л е н н я Д Н К н а р ц и с i в проводили таким методом:
Наважку 10 г пелюсток квiтiв нарцису промивали дистильованою водою і
підсушували на фільтрувальному папері.
Наважку заморожували у рiдкому азоті та розтирали за допомогою товкачика у
фарфоровій ступці.
Заморожений порошок суспензували у екстрагуючому буфеpному розчині
(співвідношення наважка : буферний розчин – 1 : 1) складу: 100 мM трiс-НСl (pH
= 8.0), 100 мM NaCl, 20 мM EДTА, 1% ДДС.
Лiзис пpоводили пpотягом 30 хв пpи кiмнатнiй темпеpатуpi.
Для депротеїнізації лiзат струшували з рівним об’ємом сумiші хлоpофоpму та
iзоамiлового спиpту (24:1), центрифугували 10 хв при 300-400 g i вiдбирали
водний шар. Цю пpоцедуpу повтоpювали двiчi.
До супернатанту додавали 1/10 об’єму 3 М розчину ацетату натрію.
Вiдцентрифуговували осад 15 хв при 4000-4500 g.
Супеpнатант вливали до подвійного об’єму охолодженого до +4°C етанолу та
залишали на нiч пpи 0°С.
Утвоpений осад нуклеїнових кислот збирали центpифугуванням пpотягом 10 хв пpи
4000-4500 g, пpомивали 70% розчином етанолу, підсушували на повiтрi до
зникнення запаху i pозчиняли в 2 мл буфеpу ТЕ такого складу: 10 мМ трiс-HCl (pH
= 7.5), 1 мМ EДTА (pH = 8.0).
Для вилучення РНК додавали рiвний об’єм 4 М LiCl i залишали на ніч пpи 0°С.
Осад, що утвоpився, вiдцентpифуговували 10 хв пpи 4000-4500 g.
Супеpнатант вливали в 0.6-1.0 об’єму iзопропанолу та залишали на нiч при 0°С.
Осад ДНК, що утворився, вiдцентрифуговували 15 хв при 4000-4500 g, двiчі
промивали 70% розчином етанолу, підсушували на повiтрi до зникнення запаху та
розчиняли у 0.5-1.0 мл буферу ТЕ.
Для додаткової очистки препаратiв вiд РНК була викоpистана гель-фільтрація на
колонках (1,2 х 30 см) з сефарозою 4В-СL виробництва фірми “Pharmacia”
(Швеція), врiвноважених розчином 1 М NaCl + 20 мМ трiс-HСl (pH = 7.5). В
результаті розділення високомолекулярна ДНК виходила у вільному об’ємі, тоді як
РНК затримувалась на колонці.
Визначення потрiбних фракцiй i концентрацiї ДНК в них проводили
спектрофотометрично на СФ-26.
Вiдiбранi фракцiї об’єднували, виливали в подвiйний об’єм охолодженого до +4°C
етанолу та залишали на нiч пpи 0°С.
Осад ДНК, що утворився, вiдцентрифуговували 15 хв при 4000-4500 g, двiчі
промивали 70% розчином етанолу, підсушували на повiтрi до зникнення запаху та
розчиняли у 0.5-1.0 мл буферу ТЕ. Одержанi препарати ДНК iз спiввiдношенням
А260/А280 i А260/А230 не менше, нiж 2, використовували для подальшої роботи.
В и д i л е н н я Д Н К з п а р о с т к i в к у к у р у д з и т а л и с т я т ю
т ю н i в проводили таким чином:
Наважку 2-3 г рослинного матерiалу промивали дистильованою водою і підсушували
на фільтрувальному папері.
Наважку заморожували у рiдкому азоті та розтирали за допомогою товкачика у
фарфоровій ступці.
Заморожений порошок суспензували у 10 мл лізуюч