РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Протокол дослідження: дизайн дослідження, критерії включення в дослідження, розподіл хворих по групах.
У дослідження було включено 120 хворих з первинним гострим інфарктом міокарду (ГІМ) із зубцем Q, госпіталізованих в інфарктне відділення 6-ої міської лікарні м. Сімферополя.
Критеріями включення в дослідження були:
1) пацієнти чоловічої статі.
2) діагноз ГІМ із зубцем Q.
3) госпіталізація хворих до 6 годин від початку ГІМ.
Критеріями виключення з дослідження при госпіталізації були наступні критерії:
1) супутня патологія, що значно впливає на прогноз життя (гострі порушення мозкового кровообігу (ОНМК), злоякісні новотвори, інсульт),
2) супутні інфекційні захворювання,
3) онкологічні захворювання, системні захворювання сполучної тканини, неконтрольований цукровий діабет, виражена ниркова, печіночна недостатність.
Всі дослідження проводили тричі: у найгостріший період (1 доба, до 6 годин при госпіталізації), гострий період (7 доба), підгострий період (21 доба).
Тяжкість стану пацієнтів оцінювали залежно від виразності гострої серцевої недостатності (ГСН) по Killip-Kimball (1969) [198] на 1 і 7 добу (таблиця 2.1) і хронічної серцевої недостатності (СН) Нью-йоркської асоціації серця [199, 200] - на 21 добу (таблиця 2.2).
Таблиця 2.1
Класифікація ГСН при інфаркті міокарду (Killip-Kimball, 1969)
КласКлінічні ознаки недостатностіIХрипів у легенях і третього тону не маєIIХрипи в легенях не більш ніж над 50% поверхні або присутній третій тонIIIХрипи в легенях більш ніж над 50 % поверхності легеньIVКардіогенний шок Таблиця 2.2.
Класифікація серцевої недостатності Нью-Йорскої Асоціації Серця (NYHA)
КласКлінічні ознаки недостатностіIНемає обмежень фізичної активності й впливу на якість життя пацієнтаIIСлабкі обмеження фізичної активності й повна відсутність незручностей під час відпочинкуIIIВідчутні зниження працездатності, симптоми зникають під час відпочинкуIVПовна або часткова втрата працездатності, симптоми серцевої недостатності й біль у грудині проявляється навіть під час відпочинку
У комплекс обстеження хворих були включені: фізікальне обстеження, ЕКГ, лабораторні методи дослідження, що включали визначення маркера ушкодження міокарда - тропонину I. Тропонін І визначали в сироватці крові на першу добу методом імунно-ферментного аналізу, за допомогою набору фірми "Хема"(м.Москва, кат.№291,серія 810), що дозволяє проводити кількісну оцінку рівня тропонину I [201].
Для порівняльної оцінки стану антиендотоксиновго імунітету у хворих з інфарктом міокарду та участь даного типу імунітету в процесах імунного запалення при ІХС використовували групу порівняння, що склали хворі (30 пацієнтів чоловічої статі) зі стабільною стенокардією напруги II і III ФК. Діагноз стабільна стенокардія напруги встановлювалася на підставах рекомендацій Української асоціації кардіологів [209]. У даній категорії хворих також виключали наявність супутніх інфекційних захворювань. Групи дослідження були порівнянні за віком та статтю.
Контрольну групу склали 98 донорів Кримської Республіканської станції переливання крові, які були порівняні за віком і статтю з дослідною групою. При дослідженні волонтерів звертали увагу на висновок фахівців в амбулаторній карті. Критерієм включення у вибірку був висновок "здоровий". Для цієї групи проводили тільки аналіз біохімічних і імунологічних показників.
2.2. Методи визначення загальних імуноглобулінів класів A, M і G
Для дослідження імуноглобулінів A, M і G використовували тест-системи "Імуноглобуліни А, М, G-ІФА" виробництва ТОВ НВЛ "Гранум".
Методика проведення: вносили в лунки по 100 мкл фосфатно-сольового буферу (ФСБ), стандартного й досліджуваного зразку в 2-х повторах > вносили по 100 мкл відповідних кон'югатів > інкубували стріпи 60 хв при кімнатній температурі на шейкері >промивали планшет 4 рази із ФСБ >вносили по 100 мкл субстратної суміші > інкубували 15 хв у захищеному від світла місці >вносили 100 мкл зупиняйочого розчину > через 5 хв визначали оптичну щільність на аналізаторі "StatFox 2100" на довжині хвилі 450 нм.
Концентрацію зразків визначали по формулі: Сх=Опк Х Ск/Опх, де Опк - оптична щільність стандартного зразку, Ск- концентрація імуноглобуліну в стандартному зразку, Опх - оптична щільність досліджуваного зразку, Сх - концентрація імуноглобуліну в досліджуваному зразку.
Вміст імуноглобулінів у стандартному зразку: IgА - 2,02 г/л, IgМ - 1,17 г/л, IgG - 10,64 г/л.
Очікувані коливання ОП стандартного зразка для IgА не нижче 0,3 оптичних одиниць (ОО), IgМ не нижче 0,3 ОО, IgG не нижче 0,4 ОО.
2.3. Методи визначення антиендотоксинових антитіл класів A, M і G
На першому етапі нами було підібране оптимальне середовище й відпрацьована методика культивування грамнегативних ентеробактерій - Escherichia coli K235. Найбільший вихід біомаси бактерій досягався при використанні рідкого живильного середовища Лурія-Бертані (LB), що має наступний склад: пептон - 10 г/л; дріжджовий екстракт - 5 г/л; NaCl - 10 г/л. рН середовища доводили до 7,5 за допомогою NaOH і стерилізували автоклавуванням протягом 30 хв при 0,5 атм. 1 мл нічної культури відповідного штаму E. coli вносили в 1-літрову колбу Ерленмейєра з 200 мл середовища LB і культивували протягом ночі при 37 °С при постійному струшуванні. Біомасу бактерій відокремлювали центрифугуванням протягом 30 хв при 6000 хв-1; для видалення залишків живильного бактеріального середовища масу двічі промивали 0,14 М NaCl. Вихід сирої біомаси E. coli K235 при зазначених вище умовах культивування в перерахуванні на 1 л живильного складу середовища в середньому (4,5 ±0,5 г).
Для виділення ЛПС був використаний метод екстракції сумішшю фенол-вода, спрямованими на спрощення методики й підвищення якості одержуваних препаратів ЛПС. На відміну від оригінальної методики, біомасу бактерій не висушували, а використовув