Розділ 2
Матеріали та методи дослідження
Для реалізації поставлених завдань обрано наступні методи дослідження:
- мікробіологічні (забір матеріалу з поверхні шкіри, визначення щільності
бактерійних популяцій та угруповань, оцінка чутливості бактерій до антибіотиків
і мірамістину);
- біохімічні (ідентифікація виділених культур);
- медико-статистичні (статистична обробка результатів дослідження)
2.1. Загальна характеристика обстежених
Для досягнення поставлених завдань мікробіологічними методами обстежено 94
особи. Їх було поділено на дві основні групи: здорові (50 осіб чоловічої статі
віком від 18 до 26 років і хворі (44 особи чоловічої статі віком від 18 до 51
року) з клінічними проявами дерматомікозів, які перебували на лікуванні у
Тернопільському шкірно-венерологічному диспансері та Тернопільській військовій
частині А 1769.
У них вивчено мiкробiоценоз шкiри та його екологічні параметри в топодемах
нижніх кінцівок (тильна поверхня стопи і ІV міжпальцевий проміжок).
Двадцять шість хворих підлягали повторному обстеженню в зв’язку з тим, що їм
місцево застосовували розчин мірамістину для вивчення його впливу на мікробну
спільноту шкіри.
2.2. Штами мiкроорганiзмiв, живильні середовища
При мiкробiологiчних дослiдженнях зі шкіри різних топодемів виділено 671 штам
аеробних і факультативно анаеробних бактерій, якi належали до 19 родiв. У
видiлених штамів вивчено морфологiчнi, тинкторiальнi, культуральнi, бiологiчнi
та iншi властивостi (продукцiя пiгментiв, каталази, оксидази, плазмокоагулази,
лецитинази, лiзоциму, фосфатази, ацетоїну, гемолiзинiв, здатнiсть вiдновлювати
нiтрати в нiтрити, окислення рiзних вуглеводiв i спиртiв тощо) та чутливість до
антибiотикiв.
Для реалізації поставленої мети щодо дослiдження мiкробiоценозу шкiри
використовували виготовленi в лабораторiї, щільні та рiдкi живильні середовища.
Готували 1 % глюкозний МПА, кров`яний МПА з 5 % еритроцитiв кролика або барана
для вивчення гемолiтичних властивостей, жовтково-сольовий агар для виділення
стафiлококiв, середовища Ендо для обліку ентеробактерiй, фуразолiдоно-твiновий
агар (ФТА) – для диференцiа-цiї та кiлькiсного облiку мiкрококiв та
коринебактерiй, середовище Сабуро – для оцінки наявності кандид.
2.3. Методика дослiдження мiкрофлори шкiри
Для забору матеріалу при вивченні мiкробiоценозу шкіри (тильна поверхня і
четвертий міжпальцевий проміжок ступні використовували метод змивiв-зiскобiв
Williamson i Kligman [54], модифiкований С.І. Климнюком і С.І. Ситником [60].
До дослiджуваної дiлянки шкiри з метою її обмеження прикладали скляний цилiндр
площею поперечного перерiзу 1,0 см2 і притискали до неї. У нього вносили 1 мл
0,1 % розчину тритону Х-100 в 0,075 М фосфатному буферi рН 7,9, і спецiальним
сталевим робочим елементом з насiчками, помірно його натискуючи, проводили
зiскоб мiкрофлори. Цю процедуру повторювали двічі. Отримані змиви змішували в
одній пробірці, а потім готували десятикратні розведення в 0,05 % розчинi
тритону Х-100 в 0,075 М фосфатному буферi з метою попередження агрегацiї
бактерiй. По 0,1 мл розведених проб засівали на селективнi та неселективнi
живильні середовища, iнкубували при оптимальнiй температурi. Через 24-96 годин
пiдраховували кiлькiсть колонiй за допомогою приладу ПСК. Результат виражали
числом колонiєутворюючих одиниць (КУО) на 1 см2 площі шкiри за формулою:
Х = 20 х М х n, (2.1)
де Х – число КУО/см2,
20 – постiйний коефiцiєнт при посiвi 0,1 мл проби,
М - кiлькiсть колонiй, що виросли,
n - розведення (в 10, 100, 1000 разiв тощо).
Оскільки число мiкробiв на одиницю площі може сягати десятків тисяч особин і
більше для зручності оцінювання рівня колонізації використовували десятковий
логарифм цього показника - lg КУО/см2. Так як тритон Х-100 має незначну
бактерицидну дію, матеріал засівали на живильні середовища не пiзнiше 1 год
пiсля забору матеріалу.
За даними авторів [54] метод дозволяє бiльш точно визначити рiвень бактерiйної
колонізації за рахунок того, що тритон має дезагрегаційну здатність. Отож,
кількість мікроорганізмів на одиницю площі шкіри буде більшою, відповідно
достовірніше можна визначити склад мікробіоценозу шкіри.
2.4. Ідентифікація мікроорганізмів
Мiкроорганiзми iдентифiкували згiдно класифiкацiї Bergey (1997) [84, 248],
додатково для диференцiацiї окремих видів бактерій використано схеми,
представлені у методичних рекомендаціях «Методика бактеріологічного контролю
мікрофлори шкіри» (1995) [61]. У мікробів визначали морфологічні,
тинкторіальні, культуральні, біохімічні властивості.
2.5. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків
Антибіотикочутливiсть одержаних штамiв визначали на середовищi АГВ за допомогою
дискодифузійного метотоду Кірбі-Бауера.
Бактерійну суспензію чистої культури мікроорганізмів (105 КУО/мл) у стерильному
фізіологічному розчині об’ємом 1 мл рівномірно розподіляли на поверхні
середовища АГВ, надлишок рідини відсмоктували піпеткою, і чашки підсушували при
кімнатній температурі протягом 20-30 хвилин. На поверхню живильного середовища
пінцетом накладали диски з антибіотиками. Чашки інкубували при оптимальній
температурі протягом 24-48 годин. Цифрові значення діаметрів зон затримки росту
бактерій порівнювали із контрольними значеннями, представленими у спеціальних
таблицях. За рівнем чутливості штами відносили до однієї з трьох категорій:
стійкі, помірно-стійкі, чутливі. Для контролю за умовами стандартизації
експерименту у досліді використовували тест-культури Esherichia coli (ATCC
25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853), зони затримки росту яких співставляли із отриманими даними для
досліджуваних штамів.
Рез
- Киев+380960830922