Розділ 2
Матеріал та методика дослідження
Експериментальна частина роботи виконана в 2005–2007 рр. на базі проблемної
наукової лабораторії внутрішніх незаразних хвороб тварин кафедри терапії і
клінічної діагностики Національного аграрного університету.
Для досліджень відбирали матеріал від 27 (3-х, 5-ти та 7-ми місячних) плодів
великої рогатої худоби, період розвитку яких визначали морфометрично (Студенцов
А.П., 2000). Плоди отримували від клінічно здорових корів голштинської породи
під час вимушеного забою на м’ясокомбінаті “Ювілейний” (м. Дніпропетровськ) з
дотриманням положення ветеринарного законодавства “Про попередження наслідків
стихійного лиха” (посуха).
Після евтаназіі плодів розтинали черевну порожнину, видаляли порожню кишку,
промивали її фізіологічним розчином (NaCl–HEPES, рН 7,4) для видалення вмісту.
Для виділення ентероцитів порожню кишку відділяли від брижі, визначали її
загальну довжину, знаходили середину, від якої відміряли рівновіддалені точки у
краніальному та каудальному напрямах та відрізали ділянку кишки. При цьому
довжина кишки складала третину від загальної (у ранній плідний період середня
довжина цієї ділянки складала 0,8 м; у пізній плідний період - 1,7 м).
Базовою методикою виділення клітин був хімічний (цитрат/ЕДТО) метод [41], на
основі якого розроблявся метод отримання очищеної фракції абсорбційних
ентероцитів із порожньої кишки плодів великої рогатої худоби.
Вихід ентероцитів визначали шляхом вимірювання концентрації білка в
інкубаційному середовищі за методом Лоурі [145]. Визначали активність лужної
фосфатази (ЛФ, КФ 3.1.3.1), як маркера зрілих стовпчастих ентероцитів за
Кінгсом-Армстронгом [132] та Гарена-Левенталя [103]. Активність
лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), як маркера деструкції клітин, визначали
за методом Севела-Товарека [196]. Питому активність ферментів наводили у двох
варіантах Ї інтервальна активність (детекція виключно за певний часовий
відрізок, не враховуючи показники попереднього) та кумулятивна активність
(детекція наприкінці часового відрізку, враховуючи показники попереднього) [71,
72]. Отримані клітини розфасовували в поліпропіленові флакони, позначали і
зберігали в рідкому азоті протягом 2-6 місяців для подальшого використання.
Отримання АМ та БМ ізольованих ентероцитів виконували за схемою Д.М. Масюка
[17, 19], яка включала такі етапи:
1. Гомогенізація суспензії клітин у ножовому гомогенізаторі MPW-302 при
швидкості обертання ножа 9,5 тис. об/хв упродовж 90 с у середовищі складом
(мМ): 250 сахарози, 5 ЕДТО, 5 тріс–НСl буфер при 4-6°С, рН 7,4 [38].
Концентрація білка ентероцитів у середовищі гомогенізації складала 1,65 мг/мл.
Ступінь гомогенізації контролювали за допомогою мікроскопа Olimpus СH-20 у
мазках забарвлених за Романовським-Гімза, при збільшенні у 1000 разів.
Критерієм якості гомогенізації були: наявність незруйнованих клітин (недостатня
гомогенізація) чи відсутність вираженого осаду при центрифугуванні (10 тис.g)
гомогенату (надмірна гомогенізація).
2. Диференційне центрифугування за допомогою рефрижераторної ультрацентрифуги
MSE High Speed 25. З метою очищення гомогенату від супутніх частин клітини та
її органел (ядер, мітохондрій) і грубих мембранних фракцій його центрифугували
при 10 тис.g упродовж 15 хв. Далі проводили центрифугування супернатанту при 15
тис.g - для виділення АМ, і при 70 тис.g - для виділення БМ, упродовж 60 хв,
кожну. Осади очищених фракцій АМ і БМ ресуспендували у фізіологічному розчині
(t 4-6°С, рН 7,4), які одразу використовували для дослідження ліпідного складу
або поміщали в поліпропіленові флакони і зберігали в рідкому азоті.
Ефективність отримання фракцій АМ і БМ ентероцитів здійснювали за виходом
мембранного матеріалу, який визначали за вмістом білка методом О. Лоурі [145].
Оцінку ступеня чистоти та забруднення мембранних препаратів здійснювали за
активністю їх маркерних ферментів: АМ Ї лужної фосфатази, активність якої
визначали за методом Гарена-Левенталя [103] і БМ - Na+,K+-АТРази (КФ 3.6.3.9),
активність якої визначали методом А. Болдирєва [28, 42].
Концентрацію загального білка у мембранних препаратах визначали за методом О.
Лоурі [145], а вміст загальних ліпідів Ї фосфорнованіліновим методом [134].
Екстракцію ліпідів АМ та БМ проводили за методом Блая-Дайера [58].
Концентрацію загального ХС в аліквоті екстракту визначали за реакцією
Кіліані-Златкіса-Зака [82], а вміст загальних фосфоліпідів (після попередньої
мінералізації зразку) – за мікрометодом Дж. Бартлета [52].
Розділення ФЛ на класи проводили методом тонкошарової хроматографії на
силікагелі (пластини ПТСХ-АФ-В 10Ч15, товщина шару сорбенту – 9 мкм, зв’язуюча
ланка – силіказоль). В якості рухомих систем використовували суміш
хлороформ-метанол-вода у об’ємному співвідношенні 65:25:4 [139]. Детекцію
проводили шляхом обприскування пластин 5%-м спиртовим розчином
фосфорномолібденової кислоти з наступним прогріванням пластин при t 120 °С.
Ідентифікацію класів ФЛ проводили шляхом порівняння отриманої Rf з
літературними даними, а також за допомогою кольорових реакцій [12]. Визначення
вмісту окремих класів ФЛ проводили шляхом вирахування площі та інтенсивності
кольору плям за допомогою оптичної програми “Densitometr”.
З метою отримання метилових ефірів ЖК, ліпідний екстракт мембранних фракцій
обробляли метилатом натрію та 3М розчином хлороводню в метанолі [78], які
очищували на пластинках ПТСХ-АФ-В у бензолі. Розділення метилових ефірів ЖК
здійснювали на газовому хроматографі “Shimadzu” (програмне забезпечення
„Мультихром”, Росія) з використанням кварцової капілярної колонки HP-PONA (J&W,
США) (довжина –
- Киев+380960830922