РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Експериментальна модель алергічного альвеоліту
Дисертаційна робота представляє собою експериментальне дослідження, виконане на
різних рівнях організації (клітинному, органному, системному, організмовому)
організму.
Дослідження проведено на 208 морських свинках (80 самців і 88 самок з
алергічним альвеолітом та 40 інтактних тварин) масою 180-220 г.
Експериментальну модель алергічного альвеоліту (АА) відтворювали методом
j.V.Fink, V.L.Moore (1980) [269] в модифікації О.О.Орехова, Ю.А.Кирилова (1985)
[143].
Захворювання викликали шляхом введення 0,2 мл повного ад’юванта Фрейнда в задню
лапку морської свинки. Через 2 тижні після імунізації 3-6 рази з інтервалом 10
діб внутрішньотрахеально вводили 0,2 мл суспензії вбитих БЦЖ.
Для першого введення з метою нагромадження антигену в легеневій тканині
використовували гомогенат БЦЖ в емульсії вазелінового масла. Як антиген в
подальших дослідженнях застосовували 1% суспензію вбитих БЦЖ у фізіологічному
сольовому розчині на 30-у, 40-у і 60-у доби.
Після першого введення антигену тварин декапітували під ефірним наркозом і
забирали кров для досліджень. Проводили розтин за стандартною методикою
А.А.Артишевського, А.С.Леонтюка (1999) [4]. Для біохімічних досліджень брали
шматочки легень і печінки. З цих тканин готували наважку, гомогенізували у
фізіологічному розчині у співвідношенні: маса наважки : розчин – 1:1 на
мікророзмільчувачі тканин РТ-2. Активність супероксиддисмутази (СОД) визначали
методом R.Fried (1975) за здатністю ферменту пригнічувати реакцію відновлення
нітросинього тетразолію супероксиданіонрадикалом [271]. Активність каталази
визначали за швидкістю руйнування перекису водню в нмоль за 1 хвилину при
довжині хвилі 240 нм за методом B.Holmes, C.Masters (1970) [277].
Вміст малонового диальдегиду (МДА) визначали за методом Э.Н.Коробейникова
(1989) [84], дієнових кон'югатів (ДК) – методом В.Б.Гаврилова, М.И.Мишкорудної
(1989) [36].
Експериментальні дослідження проводились на кафедрі патологічної фізіології
Львівського національного медичного університету ім.Д.Галицького. Визначення
тестів, які відображають процеси прооксидантної (ДК, МДА) та антиоксидантної
систем (СОД, каталаза) і стан імунної системи в крові та в легеневій і
печінковій тканинах здійснювали в інтактних морських свинок і у хворих на
експериментальний алергічний алвеоліт на 30-у, 40-у і 60-у доби розвитку
захворювання, а також після проведеної антиоксидантної терапії альфа-токоферола
ацетатом (вітаміна Е ацетатом), який застосовували впродовж 10 днів перорально
в дозі 100 мг/кг маси тварини.
Усі тварини розподіляли на 5 груп:
перша – 40 інтактні морські свинки складали контроль;
друга – морські свинки (40) з експериментальним АА (30 доба від початку
введення антигену), до лікування АТФА;
третя – морські свинки (40) з експериментальним АА (40 доба від початку
введення антигену), до лікування АТФА;
четверта – морські свинки (40) з експериментальним АА (60 доба від початку
введення антигену), до лікування АТФА;
п’ята – морські свинки (48) з експериментальним АА, після лікування
АТФА.
Разом з тим, для зручності опису та інтерпретації одержаних даних, а також в
залежності від часу пройденого з моменту першого введення антигену і до
здійснення лабораторних досліджень умовно виділяли два періоди розвитку
захворювання – ранній та пізній.
Ранній період – 30-а і 40-а доби модельного процесу АА від початку введення
антигену;
Пізній період – 60-а доба АА від початку введення антигену.
2.2. Методи досліджень
Тести, які характеризують функціональний стан прооксидантної системи при
експериментальному АА:
а) дієнові кон’югати;
б) малоновий диальдегід.
2.2.1. Визначення дієнових кон’югатів. За методом В.Б.Гаврилова,
М.И.Мишкорудной [36].
До плазми крові 0,2 мл додавали суміш 2,0 мл ізопропілового спирту та 2,0 мл
гептану. Струшували впродовж 15 хвилин. Потім додавали 1,0 мл розчину
хлористоводневої кислоти (рН 2,0) та 2,0 мл гептану. Струшували. Після
відстоювання та разшарування фаз через 30 хвилин відбирали верхній гептановий
шар, і в ньому визначали оптичну густину при довжині хвилі 233 нм. проти
контролю. Використовували як контроль зразок, в якому замість плазми крові є
0,2 мл води. Дієнові кон’югати були виражені у нмоль/мл (г).
2.2.2. Визначення малонового діальдегіду. За методом Є.Н.Коробейникова [84].
Вносили в пробірку 0,5 мл сироватки крові, додавали 5,0 мл 20%-ного розчину
фосфорно-вольфрамової кислоти, перемішували та залишали в холодильнику 15
хвилин. Потім центрифугували при 40С 15 хвилин при 2500 об/хв. Зливали
надосадочну рідину, а до осаду додавали 2,0 мл дистильованої води, 1,0 мл
0,8%-ного розчину тіобарбітурової кислоти, ретельно перемішували, слідкуючи за
рН суміші, герметично закривали корками та інкубували проби 60 хвилин на
водяній бані при 1000С. Після цього пробірки охолоджували та центрифугували при
6000 об/хв. 10 хвилин. Реєстрували оптичну густину в центрифугаті на
спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 535 та 580 нм. для виключення
оптичного поглинання забарвлених комплексів тіобарбітурової кислоти речовинами
неліпідної природи.
Розрахунок здійснювали за формулою:
С = 0,21 + 26,5 D, де
С – концентрація МДА в наномолях на 1 мл сироватки крові;
D – показник D535 – D580 в центрифугаті.
Показники, що характеризують функціональний стан антиоксидантної системи при
експериментальному АА:
а) супероксиддисмутаза;
б) каталаза
2.2.3. Дослідження активності супероксиддисмутази. За методом Fried R. [271].
Готували реакційну суміш, змішуючи 1,2 мл 0,15 М фосфатного буфера
- Киев+380960830922