РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ та об’єкт ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження
Для вивчення вікових особливостей дії тетрахлорметану та солянокислого
гідразину на перебіг окиснювальних процесів використовували білих нелінійних
щурів-самців трьох вікових періодів: статевого дозрівання (молоді, 3-міс., маса
70-120 г); статевої зрілості (дорослі, 8-10-міс., маса 150-220 г); старіння, в
яких процеси катаболізму переважають над процесами анаболізму (старі,
18-24-міс., масою 300 г і більше) [331], яких утримували на стандартному
рацiонi віварію. Всіх піддослідних тварин розділили на такі групи: I –
iнтактнi; II - ураженi тетрахлорметаном; III - уражені солянокислим гідразином;
IV – уражені тетрахлорметаном, яким проводилась корекція карнітину хлоридом; V
– уражені солянокислим гідразином, яким проводилась корекція карнітину
хлоридом; VI – уражені тетрахлорметаном, яким проводилась корекція ліпосомами;
VII - уражені солянокислим гідразином, яким проводилась корекція ліпосомами;
VIII - уражені тетрахлорметаном, яким проводилась корекція ліпосомами та
ентеросорбентом “Силард П”; IX - уражені солянокислим гідразином, яким
проводилась корекція ліпосомами та ентеросорбентом “Силард П”. В процесі
виконання роботи використано 972 тварини. Тетрахлорметан вводили
внутрішньоочеревинно одноразово з розрахунку 2 г/кг маси тіла у вигляді 50 %
олійного розчину на оливковій олії [122]. Інтактнi тварини отримували
ідентичний об’єм оливкової олії. Гідразин вводили внутрішньоочеревинно
одноразово у вигляді 6 % водного розчину солянокислого гідразину (NH2-NH2·2HCl)
із розрахунку 0,3 мл на 100 г маси тіла тварини (56 мг/кг у перерахунку на
чистий гідразин) [158]. Інтактні тварини отримували внутрішньоочеревинно
ідентичний об’єм 0,9 % розчину NaCl. Декапiтацiю тварин, уражених
тетрахлорметаном проводили під легким ефірним наркозом через 24 год, 3 та 7
діб, а тварин, уражених солянокислим гідразином через 24 год, 48 год, та 5 діб
від моменту введення отрут, що відповідає періодам жирової інфільтрації,
виникнення вогнищ некрозу на фоні посиленого відкладання жиру та початку
регенераторних процесів [351,387]. Для дослідження використовували цільну кров,
плазму крові, сироватку крові, гомогенат печінки, мікросоми та мітохондрії
гепатоцитів. Експерименти на тваринах проводили у відповідності з “Правилами
використання лабораторних експериментальних тварин”.
Фармакопейний 20 % розчин карнітину хлориду розводили в 10 разів ізотонічним
розчином натрію хлориду і вводили внутрішньоочеревинно щоденно в дозі 50 мг/кг
у всі дні проведення експерименту [339].
Суспензію холінфосфатидних ліпосом вводили внутрішньоочеревинно щоденно в дозі
100 мг/кг протягом усього експерименту [213].
Ентеросорбент “Силард П” вводили внутрішньошлунково зондом із розрахунку 1 г/кг
маси тіла щоденно на протязі всього терміну експерименту одночасно з уведенням
суспензії ліпосом.
2.2. Дослідження процесів вільнорадикального окиснення (ВРО) та стану
антиоксидантної системи (АОС)
2.2.1. Метод визначення концентрації ТБК-активних продуктів
Принцип методу полягає у здатності малонового діальдегіду при взаємодії з
тіобарбітуровою кислотою в кислому середовищі утворювати забарвлений комплекс,
інтенсивність якого адекватна вмісту ТБК-активних продуктів. Дослідження
проводили у плазмі або 10 % гомогенаті печінки [8] .
У центрифужні пробірки наливаємо по 1 мл дистильованої води, 1 мл 10 %
гомогенату або 0,5 мл плазми, 2 мл 30 % р-ну трихлороцтової кислоти, 0,2 мл 5 М
HСl, 2 мл тіобарбітурової кислоти і витримуємо 15 хв. на водяній бані при 100
°С. Проби охолоджували, осад відділяли центрифугуванням при 3000 об/хв. Проби
центрифугували 10 хв. і вимірювали оптичну густину верхньої фази на
фотоелектроколориметрі КФК-3 при l=535 нм проти води як контролю. Розрахунок
проводили враховуючи коефіцієнт молярної екстинкції для ТБК-активних продуктів,
який дорівнює 1,56ґ105 мольґсм-1.
Активність виражали в мкмоль/л у плазмі крові та мкмоль/кг в гомогенаті
печінки.
2.2.2. Визначення вмісту гідропероксидів ліпідів (ГПЛ)
Вміст ГПЛ визначали за методом [71], який ґрунтується на тому, що екстраговані
гептан-ізопропіловою сумішшю гідропероксиди мають відповідний максимум
поглинання при l= 232 нм.
До 0,2 мл плазми або 10% гомогенату додавали 4 мл суміші гептан-ізопропанолу
(1:1) і струшували 15 хв на лабораторному струшувачі АВ-30 с. Потім у пробірки
додавали по 1 мл розчину НСІ (рН=2,0) і 2 мл гептану, інтенсивно струшували і
після відстоювання та розшарування суміші (через 30 хв) відбирали гептановий
шар і вимірювали його оптичну щільність на спектрофотометрі СФ-46 при l=232 нм.
Як контроль використовували пробу, яка містила 0,2 мл дистильованої води
замість досліджуваного матеріалу. Розрахунок вмісту ГПЛ проводили у відносних
одиницях за формулою:
С= 10ґЕґV1/V2 , (2.1)
де Е - оптична щільність гептанового шару проби,
V1 - кінцевий об’єм гептанового екстракту (4 мл),
V2 - об’єм досліджуваного матеріалу (2 мл).
Вміст ГПЛ виражали в умовних одиницях екстинкції (ум.од.): у плазмі ум.од/мл
плазми, в гомогенаті печінки ум.од./г печінки.
2.2.3. Визначення вмісту основ Шифа (ШО).
Основи Шифа – це кінцеві продукти ПОЛ, які реєструються за допомогою
флуоресцентного аналізу. Їх флуоресценція обумовлена кон’югованою системою
1-аміно-3-імінопропенової групи, яка утворюється внаслідок біфункціональної
реакції малонового діальдегіду з донорами аміногруп.
Методика визначення флуоресціюючих основ Шифа наступна: до зразка тканини,
масою 0,2 г додавали суміш хлороформ-метанолу у співвідношенні 2:1. Суміш
поміщали гомогенізували при температурі 45 оС
- Киев+380960830922