РОЗДІЛ 2. методи ДОСЛІДЖЕНЬ
Флуоресцентна кальціометрія
Різноманітні кальцієві барвники та їх кон’югати із різними молекулами, що
створені для цілеспрямованої зміни властивостей кальцій-залежних флуоресцентних
зондів були використані під час виконування даної дисертаційної роботи. Їх
хімічні і фізичні властивості, а також деталі застосування в роботі описані в
даній главі.
Вимірювання за допомогою двохвильових кальцієвих зондів
Вимірювання за допомогою fura-2
Для кількісного визначення концентрації вільного цитоплазматичного кальцію в
ацинарних клітинах панкреатичної та слинних залоз в дослідах, що виконувались
із застосуванням метода краплини, використовували ацетоксиметилову (АМ)
мембраннопроникнену форму барвника fura-2 (fura - 2/АМ) [129, 160, 182, 257,
323, 373]. Хімічна формула даного з'єднання представлена на рисунку 2.1.
При зв’язуванні fura-2 із кальцієм відбувається характерне зміщення спектра
збудження цього барвника. При збудженні світлом із довжиною 390 нм відбувається
зменшення інтенсивності флуоресценції, а при збудженні світлом, із довжиною
хвилі 340 нм - збільшення. На рисунку 2.2. представлені спектри випромінювання
зонда fura-2 при різних концентраціях вільного кальцію у розчину. Максимум
флуоресцентної емісії припадає на довжину хвилі 510 нм. Спектри збудження і
поглинання барвника fura-2 представлені на рисунку 2.3.
Однак, довжина хвилі 340 нм являє собою вже ультрафіолетове (УФ) світло, і для
її використання є необхідним мікроскоп із кварцовою оптикою. Оскільки в нашому
випадку були використані як звичайний, так і УФ мікроскопи, то друга довжина
хвилі вибиралася на 360 або 340 нм, відповідно. Слід відзначити, що 360 нм – це
ізобестична точка зонда fura-2, тобто, флуоресцентний сигнал при збудженні
світлом даної довжини хвилі не залежить від концентрації Ca2+ і являє собою
функцію лише концентрації зонда.
Знаючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції при збудженні двома довжинами
хвиль, можливо розрахувати [Ca2+]i в клітині за наступною формулою, що була
запропонована Гринкевичем та співавторами в 1985 р. [133]:
[Ca2+]i = Kd · b · (R - Rmin)/(Rmax - R) [1]
Де Кd - константа дисоціації комплексу fura-2 із кальцієм, R=F360/F390 –
поточне відношення флуоресцентних сигналів, Rmin = F360/F390 |Ca0 – те ж
співвідношення в розчині із низькою концентрацією Ca2+, Rmax = F360/F390 |CaҐ -
те ж співвідношення в розчині із високою концентрацією Ca2+, b =
F390|Ca0/F390|CaҐ - відношення флуоресцентних сигналів при низькій і високій
концентраціях Ca2+ при збудженні довжиною хвилі 390 нм. Параметри Rmin, Rmax и
b знаходили експериментально.
Визначення констант, що входять до рівняння [1] проходило наступним чином. Для
визначення Rmax , використовували базовий розчин із підвищеною концентрацією
Ca2+ (1 мМ) і що мав у складі високу (10 мкМ) концентрацію іонофору іономіцину.
Для визначення Rmin , використовувався базовий розчин без додавання Ca2+ і з
додаванням EGTA - 10 мМ і іономіцину - 10 мкМ.
Відношення величин флуоресценції визначалось в ацінарних клітинах, що були
поміщені до вищеприведених розчинів на дно експериментальної камери. В
результаті калібрування нашої системи, значення констант, що входять до
рівняння [1] складали відповідно: Rmin= 0.8; Rmax= 9.2 и b= 16. Константа
дисоціації комплексу fura-2 із кальцієм була взята із каталогу Molecular Probes
і дорівнювала 224 нМ (нмоль/л).
Для введення кальцій - чутливого зонда в клітину, ізольовані ацинарні клітини і
їх малі кластери містились у базовий розчин, що мав у складі етерификовану
незаряджену форму барвника fura-2 ацетоксіметілестер, в концентрації 5 мкМ,
розчинену в діметілсульфоксиді із додаванням детергенту Плуронік F-127 (0.02%)
(всі речовини були закуплені у компанії Molecular Probes, США). В такій формі
барвник проникає в клітину, потім ендогенними естеразами ефірні групи
відщеплюються, а зонд стає зарядженим, і покинути клітину не може. Фарбування
проводилось 20-50 хвилин при температурі 22-35оС. Після фарбування клітини
переносилися до базового розчину, де додатково відстоювались на протязі 40 хв
для повної деетерифікації fura-2/АМ. Концентрація зонду в клітині визначалась
шляхом титрування пофарбованих клітин розчином барвника, що додавався до
позаклітинного розчину. Оцінена таким чином концентрація зонда в клітині була в
діапазоні 50 – 200 мкМ.
В деяких дослідах ми також використовували інший двохвильових (по емісії
флуоресценції) кальцієвий індикатор indo-1. Процедури його введення до клітин
та послідуючих вимірювань була аналогічною до процедур використання fura-2.
Вимірювання за допомогою однохвильових кальцієвих зондів
Вимірювання за допомогою Fura Red
Для кількісного визначення концентрації вільного цитоплазматичного кальцію в
ацинарних клітинах панкреатичної та слинної залоз в дослідах із уповільненням
дифузії Са2+ за допомогою кон’югатів кальцієвих барвників із
високомолекулярними декстранами використовувалась мембран-проникна форма
барвника Fura Red (Fura Red/АМ) [82, 284, 296, 340], хімічна формула даної
сполуки представлена на рисунку 2.4.
При зв’язуванні Fura Red з іонами кальцію відбувається характерна зміна спектра
збудження цього барвника. Зокрема, при збуджені світлом із довжиною хвилі 488
нм відбувається зменшення інтенсивності флуоресценції цього барвника, що
реєструється на довжинах хвиль понад 560 нм. На рисунку 2.5. представлені
спектри випромінювання зонда Fura Red, за різних концентрацій вільного кальцію
у розчині. Максимум емісії флуоресценції приходиться на довжину хвилі 670 нм.
Знаючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції при збудженні на певній (488
нм) довжині хвилі можна розраху
- Киев+380960830922