Розділ III, 3.8) досліджувані зразки продуктів ПЛР, що містять тільки очікуваний фрагмент ДНК довжиною 1414 п.н. (як можна бачити із рис. 5.1Б), були візуалізовані шляхом АСМ. АСМ-зоб-раження ПЛР-продукту після проведення ПЛР з ДНК-полімеразою Invitrogen Platinum наведено на рис. 5.2.
Зразки ДНК у HEPES буфері, що містить іони магнію, були адсорбовані на
Рис. 5.2. Зображення ампліфікованого фрагмента ДНК pGEMEX, отримане за
допомогою атомно-силової мікроскопії. Очікувана довжина амплікона
становить 1414 п.н., або 485 нм у припущенні В-форми ДНК. Зобра-ження ДНК були записані у повітрі у режимі вiбруючого варiанта АСМ. Крапля розчину зразка у 10 мM HEPES буфері, що містить 2 мM MgCl2, була нанесена на поверхню свіжосколотої слюди та вису-шена. Розмір кадру - 1,5 мкм Ч 1,5 мкм [21].
поверхню свіжосколотої слюди. У цьому випадку поверхня слюди характеризу-
ється меншим ступенем адсорбції порівняно з іншими відомими методами об-робки слюди, такими як аміносиліконування поверхні слюди в рідині [125, 251] та парах похідних аміносиланів [10]. У зв'язку з цим зразки ДНК, iммобiлiзова-ні на поверхнi слюди в присутності іонів магнію, піддані меншому впливу по-верхневих властивостей слюди на конформацію ампліконів. Автори робіт [187, 272] вважають, що за такої методики підготовки зразка для АСМ здійснюється зсув рівноваги від тривимірної структури ДНК у розчині до двовимірної на по-верхні слюди. При цьому після втрати одного ступеня свободи молекули ДНК мають можливість рухатися в двох залишившихся напрямках.
Графік розподілу Гаусса контурної довжини ампліконів, визначеної з АСМ-
зображень, показано на рис. 5.3.
Рис. 5.3. Контурна довжина ампліконів після проведення ПЛР та наступної
очистки, яка була обчислена з АСМ-зображення ДНК, іммобілізова-ної на свіжосколотiй слюдi. Лінія становить Гауссів розподіл [21].
Отримане значення контурної довжини досліджуваних ампліконів - 435 нм ? 15 нм - менше теоретичного значення довжини молекул ДНК у В-формі на ~ 10 %. Раніше в роботі [187] також було відзначено, що контурна довжина моле-кул ДНК, обмірювана із АСМ-зображень молекул у повітрі, завжди менше, ніж теоретична довжина молекул ДНК у В-формі у припущенні, що відстань між парами нуклеотидів H становить 0,34 нм. Можливими причинами ефекту, що спостерігається, Bustamante C. та співавтори вважають: (і) недостатню розділь-ну здатність атомно-силового мікроскопа; (іі) неточності алгоритму обчислення контурної довжини ДНК; (ііі) наявність процедури висушування зразка ДНК перед візуалізацією шляхом АСМ. Проте, на нашу думку, перші дві з перерахо-ваних причин не можуть привести до статистично значимого зменшення кон-турної довжини ДНК. Таке зменшення довжини лінійної молекули на ~ 45 нм для амплікона довжиною 1414 п.н., або 485 нм у припущенні В-форми ДНК, іс-тотно вище погрішності вимірювання довжини за допомогою програмного за-безпечення, а також значно більше роздільної здатності АСМ для біомолекул. Висушування же зразка ДНК після нанесення на поверхню слюди може приво-дити до переходу молекул із В-форми, характерної для розчину, в конформацію, відмінну від B-форми, що, в свою чергу, може зменшувати контурну довжину молекул ДНК.
Знаючи контурну довжину амплікона (L = 435 нм), послідовність якого ста-новить 1414 п.н., нами була визначена відстань між нуклеотидними залишками амплікона - H = 0,31 нм. Із найбільш розповсюджених А-, В- та Z-сімейств по-двійної спіралі ДНК найзначніші коливання відстані H між нуклеотидами ха-рактерні для А-форми ДНК - від 0,26 нм до 0,33 нм згідно з даними рентгено-структурного аналізу [196]. Також відомо, що в А-форму переходять молекули ДНК при зменшенні відносної вологості нижче значення 76 % [196, 253]. Необ-хідно зазначити, що вищенаведені літературні дані були отримані для криста-лічної форми ДНК у волокнах. При екстраполяції цих даних на молекули ДНК, що знаходяться у розчині, а також на геномну ДНК in vivo, на наш погляд, не-обхідно враховувати декілька важливих моментів.
Крім процедури висушування зразка, яка може індукувати В ? А-перехід молекул ДНК, на конформацію ДНК істотно впливають поверхневі властивості слюди - субстрату, на якому адсорбовані молекули ДНК. Відомо, що поверхне-ві властивості слюди, насамперед поверхнева щільність заряду, у водному роз-чині електроліту визначається суперпозицією поверхневих зарядів реакційних груп у відповідності з їхніми множинними ізоелектричними точками. Оскільки на поверхні слюди експоновано силанольні групи у співвідношенні, що значно перевищує кількість іміно- та аміногруп, поверхня слюди негативно заряджена
у широкому інтервалі рН [263], включаючи і нейтральні значення рН, за яких
адсорбуються молекули ДНК для АСМ-візуалізації.
В той же час відомо, що, наприклад, при силіконуванні похідними аміноси-
лану значення рК аміногруп аміносилану поблизу поверхні слюди знижуються на 3-6 одиниць рН порівняно зі значенням рК аміногруп у розчині [84, 118], що свідчить про безпосередній вплив поверхні слюди на адсорбовані на ній моле-кули.
Наші дані корелюють з результатами декількох робіт [187, 274]. У роботі [187] за допомогою АСМ були виміряні значення контурної довжини чотирьох фрагментів ДНК, розмір яких становив 1008-1055 п.н. Визначене нами із ре-зультатів роботи [187] значення спірального райзу Н для цих ампліконів дорів-нювало 0,31-0,33 нм, а для фрагмента ДНК довжиною 538 п.н. із роботи [274] - 0,32 нм, що також відповідає характерній відстані між парами нуклеотидів уздовж осі спіралі А-форми ДНК.
Візуалізація та вимірювання довжини поодиноких молекул ДНК після амплі-фікації в полімеразній ланцюговій реакції показали, що після проведення ПЛР синтезуються фрагменти ДНК не строго фіксованої довжини (як можна було очікувати та про що свідчать результати гель-електрофорезу після проведення ПЛР), а амплікони з розподілом контурної довжини. Неоднорідність контурної довжини ампліконів у нашій роботі дорівню