РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1.Матеріали і методи досліджень2.1.1.Матеріали, які використовувались в експериментах та фірми-виробники
В експериментах використовували ацетилхолін хлорид (АХ), кофеїн (КФ), ніфедипін, пропранолол, фентоламін, тетраетиламоній, інгібітор трипсину з бобів сої фірми Sigma Chemical Co (США), атропін сульфат виробництва Воронезького хімфармзаводу (Росія), інгібітори фосфатаз фірми LC Service Corp. (США). Інші реактиви вітчизняного виробництва марки не менше ч.д.а.
Використовували також білок А (БА), виробництва фірми "Sigma" та білок А у двох формах - очищений (БАо) та клітиннозв'язаний (КЗБА) білок А, які було екстраговано з бактерій штаму Staphylococcus aureus Cowan-1 на кафедрі імунології і загальної мікробіології біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка, та пептидоглікан (ПГ) штаму Wood-46, отримані на кафедрі імунології і загальної мікробіології біологічного факультету Київського національного університету ім. Тараса Шевченка, стандартний стафілококовий токсин (СТ) виробництва Інституту епідеміології та мікробіології ім. Н. Ф. Гамалії Академії медичних наук Росії.
2.1.2. Розчини, які використовувались в експериментах
В роботі використовували слідуючі розчини:
Фізіологічний розчин Кребса (ммоль/л): NaCl - 120,4; KCl - 5,9; NaHCO3 - 15,5; NaH2PO4 - 1,2; MgCl2 -1,2; CaCl2 - 2,5; глюкоза -11,5 (рН 7.2 - 7.3).
Безкальцієвий розчин готували аналогічно з розчину Кребса при заміні іонів Са2+ еквімолярною кількістю іонів Мg2+ (рН 7.2 - 7.3).
Гіперкалієвий розчин готували шляхом заміни іонів Na2+ на К+ у розчині Кребса (рН 7.2 - 7.3).
Процедура отримання препаратів скоротливих білків серцевого та гладеньких м'язів передбачали використання наступних буферів:
Буфер А (ммоль/л): KCl - 60, АТФ - 1, гістидинового буферу - 20 (рН 7.0).
Буфер Б (ммоль/л): КCl - 50, NaN3 - 1, ДТТ - 0,5, Трис НСl - 5 (рН 7.5).
Буфер В (ммоль/л): АТФ - 10, MgSO4 - 10, трис-HCl - 20 (рН 6.8).
Буфер Г (ммоль/л): KCl - 30, EDTA - 1, ?-меркаптоетанол - 10, PMSF - 1, MgCl2 - 10, К2РО4 - 10 (рН 7.0).
Буфер Д (ммоль/л): KCl - 20, ЕДТА - 1, МgCl2 - 5, PMSF - 0,2, NaN3 - 1, ATP - 3,5, трис-HCl - 15 (pH 8.0).
Буфер Е (ммоль/л): КСl - 60, NaN3 - 1, ДТТ - 0,5, трис-НСl - 5 (рН 7.5).
Буфер Ж (ммоль/л): Na4P2O7 - 40, DTT - 1, NaN3 - 1 (pH 7.5).
2.2.Виділення скоротливих білків2.2.1.Виділення актоміозину та міозину гладеньких м'язів
Шлунок свині отримували безпосередньо після забою тварин і транспортували на льоду. Матеріал зберігали при температурі -18оС. Виділення натурального актоміозину і міозину проводили за методикою, описаною в роботі [183] з модифікаціями, розробленими у відділі біофізики Інституту фізіології ім. П.О. Богача. Шлунки звільняли від жиру, слизової та серозної оболонок, промивали холодною дистильованою водою та гомогенізували. Гомогенізовані м'язи обробляли 1% розчином Тритону Х-100, приготовленому на буфері А. Після центрифугування суспензії при 6000 g протягом 15 хв, осад екстрагували буфером А без Тритону Х-100 протягом 18 год. Екстракт відцентрифуговували при 6000 g протягом 30 хв і вважали його грубим препаратом актоміозину. В подальшому актоміозин очищали з грубого препарату актоміозину 4-разовим переосадженням останнього, після чого білок розчиняли в буфері Б і центрифугували при 20 000g протягом 30 хв. Такий актоміозин використовували в подальших дослідах.
Для виділення міозину, актоміозин дисоціювали на фібрилярний актин і так званий грубий міозин у буфері В. Після центрифугування цього розчину при 105 000 g протягом 3 год. міозин із верхньої частини надосадової рідини (біля 75% загального об'єму) осаджували буфером В з сірчанокислим амонієм при 55% насичення та в присутності 10 ммоль/л ЕДТА, рН 6.8. Осаджений міозин розчиняли у буфері Б, потім діалізували проти цього ж розчину. Освітлення розчину міозину було досягнуто центрифугуванням при 105 000 g протягом 2 год. З метою очищення від домішок, проводили хроматографічне розділення розчину міозину на колонці ДЕАЕ-Sepharose (4х45 см), зрівноваженій пірофосфатним буфером. Елюцію проводили у лінійному градієнті, який створювали системою розчинів 0.04 моль/л K4P2O7 і 1моль/л KCl. Швидкість елюції становила 20 - 30 мл/год. Усі препаративні процедури здійснювали при температурі близько 5оС.
2.2.2Виділення актоміозину та міозину серцевого м'язу
Серце бика забирали зразу після забою тварин і транспортували на льоду. Препарати скоротливих білків серцевого м'язу виділяли за методом Маргосян [184]. 100 г тканини лівого шлуночка серця подрібнювали, пропускаючи через м'ясорубку, а потім гомогенізували у міксері з трьома об'ємами буферу Г. Гомогенат центрифугували 10 хв при 6 000g. Операцію повторювали 2 рази. Наступну промивку проводили при додаванні до промивного розчину тритону Х-100 до кінцевої концентрації 1%. Після обробки детергентом та центрифугування осад подрібненого м'язу відмивали до міофібрилоподібного стану не менше п'яти разів буфером Г без тритону.
Екстракцію актоміозину проводили трьома об'ємами буферу Д протягом 1 години при слабкому струшуванні. Екстракт виділяли центрифугуванням при 10 000g протягом 40 хв. Актоміозин осаджували з супернатанту додаванням 10 об'ємів холодної дистильованої води, попередньо довівши його рН до 6.2 0,1н оцтовою кислотою. Білок, який випав в осад внаслідок цієї процедури ("грубий" актоміозин), збирали центрифугуванням при 3 000g протягом 15 хв та ділили на дві частини. Першу частину розчиняли в 60 ммоль/л КСl та осаджували, додаючи 11 об'ємів холодної дистильованої води. Цю операцію повторювали двічі. На останньому етапі актоміозин розчиняли в буфері Е та діалізували проти того самого розчину. Після діалізу розчин актоміозину центрифугували при 25 000g 30 хв. Супернатант, що отримували, являв собою так званий нерегульований актоміозин, тобто актоміозин без регуляторних білків