РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Об'єкти дослідження
Об'єктами дослідження були 8 штамів R. solanacearum. Всі культури були люб'язно надані куратором ІСМР доктором Дж. Янгом (Нова Зеландія). Штами були виділені в різних географічних зонах світу з різних рослин та за своїми властивостями віднесені до різних біоварів (табл. 2.1).
Таблиця 2.1.
Характеристика досліджених штамів R. solanacearum
Штам ІСМР
Географічна зонаБіоварРослина-хазяїн5712-типовийСША1томати767Тринідад1банани4157Нова ЗеландіяНВ*картопля7944Перу1подорожник7945Перу4картопля7955Кенія3баклажани8089Філіппіни2солодкий перець8110Шрі Ланка4картопля НВ* - не визначений
2.2. Спосіб культивування
Вирощування бактерій здійснювали методом періодичного культивування у колбах місткістю 500 мл з робочою ємністю 200 мл на кругових качалках (n=240 об/хв) протягом 31-71 годин (в залежності від штаму) при температурі 28?С. Культивування проводили на рідкому синтетичному середовищі N [162] такого складу: MgSO4 (0,2 г/л), KH2PO4 (3 г/л), Na2HPO4 (6 г/л). Як джерела азоту та вуглецю виступали NH4Cl (1 г/л) та глюкоза (5,0 г/л), відповідно.
Як засівний матеріал використовували культури із логарифмічної фази росту, які вирощували на м'ясо-пептонному бульйоні. Засів здійснювали інокулюмом в кількості 10% від загального об'єму поживного середовища.
Клітини осаджували за допомогою центрифугування при 5000?g протягом 20 хв. Одержані осади двічі промивали 0,85% розчином NaCl. Далі сиру бактеріальну масу висушували шляхом обробки ацетоном (2 рази) та ефіром (1раз).
2.3. Методи виділення та очищення ліпополісахаридів
Виділення та очищення ЛПС проводили за методом Вестфаля та Янна [163].
10-20 г висушених клітин, попередньо розтертих в ступці до порошкоподібного стану, суспендували в 350 мл води при 65-68?С (на водяній бані) протягом 3-5 хв. Далі при сильному перемішуванні додавали 350 мл 90%-вого фенолу, який нагрівали до тієї ж температури, та залишали при 65?С на 30-40 хв. Потім суміш охолоджували до ?10?С, помістивши судину до бані з льодом. Емульсію центрифугували при 5000?g протягом 25-30 хв на холоду.
Водяний шар відсмоктували, фенольний шар, інтерфазу та осад екстрагували ще двічі, додаючи по 350 мл води. Об'єднані водні екстракти діалізували протягом доби проти водопровідної, а потім при 4?С проти дистильованої води до повного видалення фенолу та невеликої кількості домішок низької молекулярної маси, після чого центрифугували при 5000?g. Супернатант концентрували у вакуумі приблизно до 100 мл та ліофільно висушували.
ЛПС очищували від нуклеїнових кислот двома шляхами:
- ультрацентрифугуванням 3%-вого водного розчину ЛПС протягом 4 год при 105000?g, після чого нуклеїнові кислоти залишалися у супернатанті, а ЛПС випадав у осад, де його розчиняли в мінімальній кількості води та ліофілізували;
- осадженням насиченим розчином ТОК протягом трьох-чотирьох годин до встановлення рН 2,0 та подальшим центрифугуванням (5000?g, 30 хв). Супернатант, що містив очищений ЛПС, діалізували проти дистильованої води до встановлення нейтрального рН, після чого ліофілізували для отримання нативного препарату ЛПС.
2.4. Одержання окремих структурних компонентів ліпополісахариів
100 мг ЛПС гідролізували 12 мл 1%-вою оцтовою кислотою при 100?С 2 год до випадіння осаду, який представлений ліпідом А. Осад ліпіду А відділяли ультрацентрифугуванням (25000?g, 40 хв) та ліофільно висушували.
Супернатант конценрували до о'бєму ? 10 мл та фракціонували на колонці (70,0 ? 3,0 см) з сефадексом G-50 при використанні 0,025 М піридин-ацетатного буферу, рН 4,5. В результаті гель-хроматографії вуглеводної частини деградованого ЛПС на сефадексі G-50 були отримані окремі структурні компоненти ЛПС: О-специфічний полісахаридний ланцюг (фракція I) та коровий олігосахарид (фракція II та фракція ІІІ), які потім концентрували у вакуумі та ліофільно висушували.
2.5. Методи біохімічного аналізу
Визначення кількості вуглеводів в препаратах ЛПС проводили за методом Dubois [164] реакцією з 5%-вим фенолом та концентрованою сірчаною кислотою. Вміст вуглеводів визначали на спектрофотометрі СФ-26 при 490 нм згідно стандартній кривій, яку будували при використанні D-глюкози в якості стандарту.
Визначення вмісту нуклеїнових кислот проводили за методом Спіріна [165], шляхом гідролізу препаратів ЛПС в 5 мл 0,5 N HСlO4 при 100?С на водяній бані протягом 20 хв. Проби охолоджували до кімнатної температури і центрифугували 20-30 хв при 5000?g. Вимір оптичної щільності супернатанту проводили на спекторфотометрі СФ-26 при довжині хвилі 270 нм та 290 нм, в якості контролю використовували 0,5 N HСlO4.
Кількість нуклеїнових кислот в зразках досліджуваних ЛПС визначали за формулою:
5?n?10,3 ,
1000
де n - кількість молекулярного нуклеїнового фосфору, що дорівнює
?А / 0,19, при ?А ? різниця між оптичною площиною при 270 нм та оптичною площиною при 290 нм. Для перерахунку кількості нуклеїнового фосфору на кількість самої нуклеїнової кислоти використовували середній перерахунковий коефіцієнт 10,3.
Визначення вмісту білку в препаратах ЛПС проводили за методом Lowry [166] без попереднього осадження 10%-вим розчином ТОК. Інтенсивність забарвлення вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при 750 нм.
Визначення гептоз проводили реакцією з цистеїном та сірчаною кислотою [167]: до двох проб по 0,5 мл, які попередньо знаходились на льодяній бані, повільно додавали по 2,25 мл 95,5%-вої H2SO4. та витримували 3 хв. Проби переносили у водяну баню з температурою 20°С на 3 хв, після чого витримували 20 хв при 100°С. Після охолодження до однієї із проб додавали 0,05 мл 3%-вого водного розчину солянокислого цистеїну, в той час як друга правила за контроль (до неї додавали дистильовану