РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1 Загальна характеристика спостережень
Вивчення патоморфозу абияких захворювань передбачає реалізацію комплексу методичних підходів для уникнення імовірних спекуляцій та спотвореної інтерпретації фактів. В зв'язку з цим першочергово були проаналізовані 20675 історій хвороб пацієнтів, прооперованих у 1987 - 2001 роках у хірургічному відділенні Київського міського центру хірургії та реабілітації хворих з патологією щитовидної залози, а також наявні в архіві цього центру матеріали патоморфологічних досліджень видалених ЩЗ чи їх фрагментів.
Для хірургічного лікування пацієнти поступали в КМЦ ХРХПЩЗ за скеруванням Київських міського і обласного протизобних диспансерів у плановому порядку. Спеціального відбору хворих для лікування за віком і нозологією не було. Переважаюча більшість прооперованих пацієнтів були жителями Києва та Київської області. Ми включили до матеріалів досліджень лише спостереження по м. Києву. Клінічне обстеження хворих передбачало фізикальні методи досліджень, ультрасонографію ЩЗ, визначення показників тиреоїдних гормонів у крові, її загальний та біохімічний аналізи. На жаль, ці дані не були присутні в усіх історіях хвороб.
Впродовж останніх шести років, завдяки наявності в КМЦ ХРХПЩЗ сучасної патоморфологічної служби, започаткованої к.м.н. І.Л. Аветис'ян, уможливлені інтраопераційні дослідження фрагментів ЩЗ. Таким чином проаналізовано 6432 спостереження, що становило 82,2% від загальної кількості оперативних втручань за цей проміжок часу.
Із запровадженням у повсякденну діяльність установи ультразвукових досліджень з'явилась реальна можливість ефективного використання тонкоголкової аспіраційної біопсії (ТГАБ) з ультразвуковою візуалізацією пункційної голки. В результаті нами проаналізовано 6450 аспіраційних біоптатів ЩЗ та відповідні цим спостереженням результати інших методів досліджень.
Сукупна кількість об'єктів наукового пошуку представлена у таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Загальна характеристика спостережень
Об'єкти спостережень у вимірі
фрагментів наукового пошукуКількість спостереженьІсторії хвороб та наявні щодо них дані патоморфологічних досліджень20675, з них 2006 - ФА і 275 - ФРРезультати УЗД щитовидних залоз29283Інтраопераційні біопати ЩЗ та відповідні видалені фрагменти ЩЗ6432, зокрема 691 - ФА і 96 - ФРАспіраційні біопати ЩЗ6450, з них 126 - ФА і 3 - ФР
2.2 Методи досліджень
Морфологічне дослідження включало первинне макроскопічне вивчення фрагментів ЩЗ, після чого її тканини фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну і проводили гістологічну обробку. Виготовлені на мікротомах МС-2 (Україна) та SM 2000R (Leica, Німеччина) препарати фарбували гематоксиліном й еозином, а також забарвлювали за допомогою ряду гістохімічних методик (PAS - реакція за Мак-Манусом, метод ван Гізона, метод Вейгерта, забарвлення конго червоним та конго червоним у модифікації ІЕПЛ, метод Моурі, сріблення по методу Гоморі, забарвлення суданом В по Беренбауму) [ 72 ].
Аналіз і фотодокументування гістологічних препаратів здійснено за допомогою дослідницького мікроскопа "Leica DMRB" (Німеччина) з параметрами збільшення у 100, 200, 400 та 1000 разів.
Для інтраопераційної діагностики використовували кріостатні зрізи, виготовлені на кріостаті "Leica CM 3000" (Німеччина).
Аспіраційну (пункційну) біопсію ЩЗ здійснювали під контролем ультразвукового апарату Aloka SSD-630 та Siemens Siena з датчиком лінійного сканування 7,5 МГц. Автор висловлює щиру вдячність щодо цього фрагменту досліджень лікарю кабінету УЗ діагностики Яровому Артуру Олеговичу.
В основу верифікації новоутворень були покладені критерії гістологічної класифікації пухлин ЩЗ [ 322 - 323 ]. Результати патоморфологічних досліджень документувались у спеціально розроблених картах (рис. 2.1).
Імуногістохімічні методи часто є вирішальними у диференціальній діагностиці пухлин, бо не дивлячись на досить високу інформативність класичних гістологічних забарвлень, в деяких випадках їх використання буває недостатнім. Суть імуногістохімічних методів полягає у визначенні локалізації антигенів за допомогою специфічних антитіл, тобто імунологічні реакції "перенесені" на предметне скло морфолога.
Важливими умовами якісного імуногістохімічного забарвлення є правильно підібраний титр і розведення антитіл, а також час та температура інкубації.
Титр антитіл - максимальне розведення сироватки, при якому спостерігається чітке специфічне забарвлення з мінімальним неспецифічним фоном. Практично всі комерційні антитіла (зокрема і використані нами - ДАКО, поліклональні, Данія) мають опис із вказівкою щодо оптимального розведення, при якому буде отримано найкращий результат. У нашому випадку - 1:200.
Температура інкубації може бути підібрана експериментально. Найчастіше інкубацію проводять при кімнатній температурі в інтервалі часу від 20 хвилин до 1 години. Водночас для прискорення процесів зв'язування антитіл з антигеном можна інкубувати зрізи при 37о С. Температура ж 4о С прийнятна для інкубації впродовж ночі. Ми інкубували зрізи при кімнатній температурі протягом 1 години.
Обов'язкова умова всіх інкубацій - вологість. Зрізи не повинні підсихати на жодному з етапів гістохімічної реакції. Тому скельця з розкапаними на зрізи антитілами ми поміщали у вологу камеру. Остання являла собою пластикову коробку з кришкою. На дні - змочені водою 2-3 шари фільтрувального паперу та дві паралельно розташовані скляні палички, на які в горизонтальному положенні
1. ПІП ................
2. № ПГД .............
3. Вік ...................
4. Стать ................
5. Інтраопераційна діагностика (діагноз):
5.1. фолікулярний рак
5.2. фолікулярна пухлина
5.3. аденома5.4. папілярний рак
5.5. медулярний рак6. Гістологічний ступінь диференціювання:
6.1. високий6.2. помірний6.3. низький7. Тип епітелію:
7.1. фолікулярний7.2. онкоцитарний7.3. світлоклітинний8. Додаткові ознак