РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Репрезентовані в роботі дані одержані на експериментальному матеріалі. Дослідження проводили, використовуючи модель метастазуючої пухлини -метастазуючу карциному легені Льюїс, яку прищеплювали мишам ліній C57Bl/6. Протипухлинні вакцини в усіх серіях дослідження готували з гомологічних клітин. Здійснювали комплексну оцінку ефективності вакцин та їх впливу на різні ланки і реакції імунної системи при проведенні імунізації до прищеплення клітин карциноми легені Льюїс (ККЛ) або після оперативного видалення первинної пухлини. Загальні відомості про характер та кількість досліджень, а також про використані методи містяться в таблиці 2.1.
2.1. Вакцини
В роботі було використано протипухлинні вакцини (серія ІЕПОР), що виготовлені з ККЛ з використанням фільтрату культуральної рідини (ФКР) росту В. subtilis 7025 (вихідна методика - вакцина 1), очищеної фракції (лектинової) цього ФКР (модифікована методика - вакцина 2), на основі глікопептидів ККЛ (вакцина 3) співробітниками відділу ензимології [12, 35, 48, 124, 144, 145].
2.1.1. Штам мікроорганізму.
В. subtilis АВ-56 - спороносний грам-позитивний сапрофітний мікроорганізм групи Subtilis-mezentericus, який був виділений Д.Г. Затулою в 1956 році [38]. Біологічно активні речовини (зокрема лектини), які продукує цей мікроорганізм, використовуються для приготування протипухлинних вакцин із пухлинних клітин [39, 40, 88]. Для покращення синтезу лектинів методом аналітичної селекції був отриманий новий продуктивний штам мікроорганізму B. subtilis, який депонований у колекції Інституту мікробіології та вірусології НАН України за номером B-7025 (тобто В. subtilis 7025) [99]. Культивування В. subtilis 7025 здійснювали за стандартною методикою в м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ). Для стандартизації і вдосконалення технології
Таблиця 2.1.
Характер та об'єм досліджень, що проведені під час виконання роботи
Характер дослідженьВикористано в експерименті тварин лінії (шт)Застосовані методики123Вивчення впливу протипухлинних вакцин серії ІЕПОР на протипухлинну резистентність організму при їх застосуванні до прищеплення ККЛC57Bl - 98 Визначення показників росту і метастазування карциноми легені Льюїс.
Визначення клітинності тимусу, селезінки, периферичних лімфовузлів та субпопуляційного складу (відносний вміст зрілих Т-, В-лімфоцитів, бластів, великих лімфоцитів) останніх.
Визначення в цитотоксичних тестах in vitro активності ПК, ЦТЛ, МФ, ефекторів АЗКЦ, неспецифічної і специфічної активності сироваток крові та впливу останніх на активність ПК.
Визначення продукції спленоцитами (неприлипаюча фракція) ІЛ-2 без додаткової стимуляції in vitro.
Визначення продукції моноцитами/макрофагами ФНП без додаткової стимуляції in vitro.
Продовження табл. 2.112 3Вивчення впливу протипухлинних вакцин серії ІЕПОР на протипухлинну резистентність організму при їх застосуванні після оперативного видалення первинної пухлиниC57Bl - 55 Визначення показників росту і метастазування карциноми легені Льюїс.
Визначення клітинності та субпопуляційного складу регіонарних і контрлатеральних щодо місця введення пухлинних клітин лімфовузлів.
Визначення в цитотоксичних тестах in vitro активності ПК, ЦТЛ, МФ, ефекторів АЗКЦ, неспецифічної і специфічної активності сироваток крові та впливу останніх на активність ПК і МФ.
Визначення продукції спленоцитами (неприлипаюча фракція) ІЛ-2 без додаткової стимуляції in vitro.
Визначення продукції in vitro моноцитами/макрофагами ФНП (без додаткової стимуляції) та ІЛ-1 (без додаткової стимуляції та за умов стимуляції in vitro ЛПС); визначення наявності ФНП в сироватці крові.Порівняльне вивчення протипухлинних вакцин (імунізацію проводили після оперативного видалення первинної пухлини), виготовлених з використанням лектинів Вacillus subtilis 7025 за умов вирощування останньої на різних середовищахC57Bl - 64 Продовження табл. 2.1123Порівняльне вивчення впливу на різні ланки імунної системи лектинів з ФКР Вacillus subtilis 7025 та виготовлених за їх допомогою протипухлинних вакцин.C57Bl - 58 Визначення відносної маси та клітинності кісткового мозку, тимусу, селезінки, периферичних лімфовузлів.
Визначення субпопуляційного складу кісткового мозку та периферичних лімфовузлів.
Визначення спонтанної та Кон А-індукованої антигеннеспецифічної супресорної активності лімфоцитів селезінки в системі адоптивного переносу сингенним реципієнтам.Математичний аналіз результатів Статистична обробка даних з використанням t-критерію Ст'юдента, критерію Пірсона; визначення коефіцієнтів кореляції.
приготування протипухлинної вакцини з використанням лектинової фракції ФКР росту В. subtilis 7025 запропоновано культивувати цей мікроорганізм, використовуючи не МПБ, а стандартизовані синтетичні поживні середовища, які забезпечують максимальний синтез біологічно активних речовин. До останніх належить оптимізоване для синтезу лектинів модифіковане середовище Гаузе [100, 107, 110].
2.1.2. Цитотоксичні лектини бактеріального походження.
Очищену фракцію (лектинову) ФКР росту В. subtilis 7025 отримували за методом, який був розроблений співробітниками Інституту (відділ природних протипухлинних речовин) [47, 89]. Культуру В. subtilis 7025 вирощували в МПБ протягом 5-8 діб при 370С в умовах підвищеної аерації. Культуральну рідину центрифугували 20 хв при 500g. Для виділення очищеної (лектинової) фракції з центрифугату використовували стандартні методичні прийоми одержання лектинів: осадження, екстракцію, сорбцію на молекулярних сорбентах та іонообмінниках. Виділені лектини мають високу цитотоксичну активність по відношенню до пухлин різного гістогенезу. У дослідженнях in vitro при їх концентрації 0,06-0,25 мг/мл спостерігається 100% цитотоксична активність по відношенню до 1,0х107 ПхК, а при вивченні проти