Генетичний контроль окремих етапів біосинтезу ландоміцину Е в Streptomyces globisporus 1912

<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ<br /> 2.1. Штами бактерій та плазміди<br /> Використані в роботі штами E.coli та актиноміцетів подано в табл.2.1. Як вектори для клонування ДНК в актиноміцетах використали плазміди pSET152, pKC1218E, pOJ260 [13], pJWH19, pTNK [1], в E.coli - pUC18/19, pBluescript 2KS+/SK+ [130]. Для секвенування lnd-кластеру використали фагову бібліотеку генів, створену на основі фагу ?-GEM11 [130]. Характеристика плазмід, які сконструйовані на основі вищезгаданих векторів, подана в таблиці 2.2. Як тест-культуру під час визначення антибіотичної активності штамів S.globisporus використовували Streptomyces albus CEST113, продуцента урдаміцинів Streptomyces fradiae Tu2717- Bacillus subtilis VKM428, продуцента аклациноміцинів Streptomyces galilaeus HKI0022 - Sarcina lutea KA37, продуцента доксорубіцину S.peucetius subsp.caesius ATCC27952 - Bacillus mycoides HB2.<br /> 2.2. Середовища та реактиви<br /> 2.2.1. Середовища та умови культивування. Для вирощування штамів актиноміцетів використовували повноцінні середовища ВС, Беннета [1], КС, R2YE [76]. Для кількісного та якісного аналізу ландоміцинів, що продукуються S. globisporus 1912 та його мутантами, використовували рідке середовище SG (г/л: глюкоза - 20, соєвий пептон - 10, CaCO3 - 2, CoCl2 - 0,001, pH до стерилізації - 7,2). Для продукції урдаміцинів, штами S.fradiae, вирощували у рідкому середовищі NL111v [56]. Продукцію аклациноміцинів штамами S.galilaeus вивчали у рідкому середовищі ФС [111]. Міцелій для отримання протопластів, а також для виділення сумарної та плазмідної ДНК, вирощували у рідких середовищах YEME, TSB [76]. Протопласти регенерували на середовищі R2YE [60]. Визначення <br /> <br /> <br />Таблиця 2.1<br />Штами бактерій використані у роботі<br />ШтамХарактеристикаДжерело отримання123Streptomyces globisporus 1912Продуцент ландоміцину Е (LaE), дикий типПроф. Б. Мацелюх, ІМВ ім. Заболотного НАН УкраїниS. globisporus LND23, LND29, LND81,LND317, LND601, LND602, LND801, LND804, LND900, LND901LaE- - мутанти S. globisporus 1912 отримані шляхом УФ-індукованого мутагенезуО.Громико, Л. Басілія, НДЛ генетики та селекції при кафедрі генетики та біотехнології ЛНУ ім. І. ФранкаS. globisporus NKNS. globisporus 1912 із зруйнованим геном lndA[1]S. globisporus SС4S. globisporus 1912, що несе плазміду pSET-SC4Отриманий в роботіS.globisporus JWH78S. globisporus 1912, що несе плазміду pJWH78-//-S.globisporus L16S. globisporus 1912 із зруйнованим геном lndL-//-S.globisporus M12S. globisporus 1912 із зруйнованим геном lndM-//-S.globisporus GT4.1S. globisporus 1912 із зруйнованим геном lndGT4 шляхом інсерційної інактивації-//-S.globisporus LD3S. globisporus 1912 із зруйнованим геном lndGT4 шляхом спрямованої делеції-//-S.globisporus GT4.1lndGT4S.globisporus GT4.1, що несе плазміду pKС1218ElndGT4.5-//-S.globisporus GT4.1lanGT4S.globisporus GT4.1, що несе плазміду pSElanGT4.3-//-S.globisporus GT4.1(pSETBX81-1)S.globisporus GT4.1, що несе плазміду pSETBX81-1-//-S.globisporus GT4.1(pSETBX81-3)S.globisporus GT4.1, що несе pSETBX81-3-//-Продовження табл.2.1. 123S.globisporus GT4.1 (pKC1218E?BX3)S.globisporus GT4.1, що несе pKC1218E?BX3-//-S.globisporus OGT4S.globisporus 1912, що несе плазміду pOGT4 (одинарний кросинговер)-//-S. coelicolor CH999Мутантний штам S. coelicolor з делецією act-кластеруПроф. П. Лідлей, Кембріджський ун-т, Великобританія S. coelicolor CH-SN6S. coelicolor CH999, що несе плазміду pSN6Створений в ході роботиS. coelicolor СH-SN6 (pIJ486lkmR)S. coelicolor CH-SN6, що несе плазміду pIJ486dnrI-//-S.fradiae Tu2717Продуцент урдаміцинів дикого типуА. Бехтольд, Фрайбурзький ун-т, ФРНS.fradiae XL5S.fradiae Tu2717, що несе плазміду pSXL62-//-S. galilaeus HKI0022Продуцент аклациноміцинів дикого типуГ. Крюгель, Ін-т природніх сполук, Йєна, ФРНS. galilaeus SXL1S. galilaeus HKI0022, що несе плазміду pSXL62-//-S. peucetius var. caesius ATCC27952Продуцент доксорубіцину дикого типуколекція культур РНЦА, Росія. S. peucetius var. caesius SXL2S. peucetius var. caesius ATCC27952, що несе плазміду pSXL62-//-Escherichia coli KW251F- supE44 galK2 galT22 metB1hsdR2 mcrB1 mcrA- argA81::Tn10 recD1014Г. Крюгель, Ін-т природніх сполук, Йєна, ФРНE. coli DH5?(F-(?80d?(lacZ)M15 recA1 endA1 gyrA96 thi1 deoR (lacZYA-argF)U169)<br />Life TechnologiesE. coli ET12567 (pUB307)ET12567 (dam-13::Tn9(Cmr) dcm-6 hsdM), що несе плазміду pUB307Проф. К.П. Сміт, Ін-т біомолекулярних студій, Манчестер. Таблиця 2.2<br />Плазміди, використані для експресії та спрямованого руйнування lnd-генів1<br />ПлазмідаХарактеристикаДжерело отримання123pKAPA,<br />3,8 т.п.н.pUC19 в полілінкер якої клонований ген стійкості до канаміцину kmGibco BRLpHP45?,<br />4,5 т.п.н.pUC19 в полілінкер якої клонований ген стійкості до стрептоміцину ?aadA [16]Ж.Л. Перноде, Політехнічний Ін-т м. Орсей, Франція.pHYG1,<br />4,5 т.п.н.pLitmus38 в HindIII- PstI- сайти полілінкера якої клонований HindIII PstI фрагмент, розміром 1,6 т.п.н. ,що містить ген стійкості до гігроміцину hygК. Олано, ун-т м. Ов'єдо, ІспаніяpIJ486lkmR, 8 т.п.н.pIJ486, що несе ген lkmR - кодує позитивний регулятор генів біосинтезу лейкемоміцинів S.griseus JA3933Г. Крюгель, Ін-т природних сполук, Йєна, ФРНpUWL201lanGT4, 7,9 т.п.н.pUWL201[153], що несе ген lanGT4 розміром 1,3 т.п.н. під промотором ErmEp*А. Бехтольд, Фрайбургський ун-т, ФРНpMun2/lanZ5,<br />5,6 т.п.н.pMun2 [153], що несе ген lanZ5 розміром 1,2 т.п.н-//-pKM2,<br />9,4 т.п.н.pBluescriptIIKS, що несе BamHI- фрагмент lnd-кластеру розміром 6,5 т.п.н. з генами prх, lndIК.Панькевич, кафедра генетики та біотехнології ЛНУ ім. І. Франкаp5XL,<br />10,1 т.п.н.pBluescriptIIKS, що несе XhoI -фрагмент lnd-кластеру розміром 13 т.п.н., з генами lndLMNOPGHQS-//-pKK3, <br />6,4 т.п.н.pBluescriptIIKS, що несе SacI - фрагмент lnd-кластеру розміром 3,5 т.п.н. з генами lndMNO-//-pKJ1,<br />7,7 т.п.н.</p>