РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1.Матеріали дослідження
2.1.2. Вірус і білки. В роботі використовували очищений диференційним центрифугуванням препарат типового штаму вірусу тютюнової мозаїки. Початкова концентрація вірусу була визначена спектрофотометрично за формулою:
С = А260?N/Ке
де С - концентрація вірусу в мг/мл, А260 - екстинкція при довжині хвилі 260 нм, N - розведення вірусного препарату, Ке - коефіцієнт екстинкції, який для ВТМ складає 2,7 [10].
Крім того, вірус був визначений у гомогенаті клітин зеленої водорості Bracteаcoccus minor, інфікованих вірусом тютюнової мозаїки (ВТМ) на стадії зооспор. Досліджуваний гомогенат був отриманий при розтиранні клітин з карбонатним буфером (рН 9,6) і відцентрифугований при 4000 об/хв. Вільний від осаду супернатант використовувався надалі для досліджень.
Також було здійснено інфікування вірусом тютюнової мозаїки Nicotiana tabacum. Рослини інокулювали механічно з допомогою абразива (карборунд) з концентрацією вірусного препарату 300 мкг/мл у 0,1 М PBS, pH7,4 у трикратному повторенні на стадії чотирьох справжніх листків [93]. Вірус визначали методами ППР та імуноферментного аналізу у гомогенатах листя, взятого на різних стадіях інфекції.
Джерелом гексону Ад2 (180 мкг/мл) слугував препарат аденовірусу людини типу 2, очищенний в градієнті щільності хлористого цезію (1,2-1,4 г/см3) після деградації його капсиду в лужному середовищі шляхом діалізу проти 0,2 М розчину карбонат-бікарбонатного буферу (рН 10,8) протягом 18 год при +4оС.
В роботі був використаний отриманий гуанідин-хлоридним методом з виділеного методом диференційного центрифугування Х-вірусу картоплі структурний білок ХВК (5 мкг/мл).
Були використані гіперімунна поліклональна сироватка кроля проти гексону і IgG-фракція гіперімунної поліклональної сироватки кроля проти структурного білка ХВК. Для імуноферментного аналізу ВТМ використовувалися гіперімунна поліклональна сироватка кроля до дикого штаму ВТМ (Український НДІ с/г мікробіології), і антитіла кози проти імуноглобулінів кроля, мічені пероксидазою ("Sіgma", США) (розведення в PBS + 1% БСА + 0,05% TWEEN 20).
У роботі також використовували імуноглобуліни класу G (IgG) людини і і антивидові IgG кози, специфічні до IgG людини ("Sіgma", США) розчинені в 0,9% NaCl у концентрації 50 мкг/мл, IgG курки і антивидові IgG кроля, специфічні до IgG курки ("Sіgma", США), розчинені в PBS (50 мкг/мл), а також білок А Staphylococcus aureus ("Sіgma", США) (водний розчин тієї ж концентрації). Для модельних експериментів з використанням ППР були взяті білки трипсин (Т), соєвий інгібітор трипсину (STI) (Radomed, Угорщина), бичачий сироватковий альбумін (БСА) (Диам, Росія). Водні розчини білків при різних рН (від 3,0 до 8,2) готували безпосередньо перед експериментом при додаванні в дистильовану воду слабких розчинів HCl і KOH. Концентрація білків у розчині складала 100 мкг/мл.
2.1.2. Реактиви. Розчини тіоціанату калію KNCS, NaNCO і пентаазамакроциклічний комплекс нікелю в концентрації 0,8?10-2М готували безпосередньо перед експериментом. Для отримання сірководню використовували соляну кислоту HCl і сульфід заліза FeS. Для модифікації поверхні золота був використаний також додекантіол HS(CH2)11CH3 ("Sіgma", США). Для створення оптичного контакту між підтримуючою призмою і скляною пластинкою використовувався поліфеніловий ефір. Гліциновий буфер (рН 2,2) карбонатний буфер (рН 9,6) і фосфатний буфер PBS (pH 7,3) готували за стандартними методиками [12].
Імуноферментний аналіз проводили в 96-лункових планшетах ("Labsystems", Фінляндія). Як хромоген використовували орто-фенілдіамінова кислоту (ОФД) "Serva", Німеччина. Для зупинки кольорової реакції в імуноферментному аналізі використовували 2М H2SO4.
Для кольорового тесту на N-бензил-1-аргінін-пара-нітроанілід за методом Ерлангера використовувалися N-бензил-1-аргінін-пара-нітроанілід, 5% розчин фосфорновольфрамової кислоти в 1 М СН3СООNa, ацетон, 0.05 М Tris:HCl, pH 7,6.
Неорганічні реагенти використовували вітчизняного виробництва, марок "хч" і "чда".
2.2.Методи дослідження
2.2.1.Поверхневий плазмонний резонанс. Поверхневі плазмони являють собою повздожно-поперечні електромагнітні хвилі, що поширюються на межі між двома середовищами, одне з яких є металом, інше - діелектриком [46]. Явище поверхневого плазмонного резонансу базується на взаємодії світла з тонкою металевою плівкою (Au, Ag, і т.п.), нанесеною на поверхню діелектрика (скло, сапфір і т.п.) [67, 68, 70]. Світло проходить через підложку і відбивається від межі між плівкою металу і зовнішнім середовищем. Залежно від спектрометра може використовуватися як монохроматичне світло - при цьому вимірюється залежність інтенсивності відбитого світла від величини кута - так і біле світло - при цьому вимірюється залежність інтенсивності від довжини хвилі при фіксованому куті [91].
В умовах повного внутрішнього відбиття світло, що падає на границю призми з нанесеною тонкою плівкою металу, може збуджувати поверхневі поляритони, що спостерігається як різке зменшення інтенсивності відбитого світла з мінімумом при певному куті, називаному кутом поверхневого плазмонного резонансу (surface plasmon resonance, SPR), Qspr [155]. При цьому положення мінімуму на кривій відбиття, Qspr, залежить не тільки від параметрів металу, але і, що більш істотно, від діелектричних властивостей середовища, зокрема, коефіцієнту заломлення n. У випадку фізичних перетворювачів, що використовують ефект поверхневого плазмонного резонансу, фізичними параметрами, вимірюваними при протіканні реакції рецептор-аналіт, є зміна коефіцієнту заломлення ?n і товщина реакційного шару d, знаючи які, можна визначити концентрацію речовини на поверхні за формулою
Г=d(na-n0)?(dn/dc)-1,
де Г - концентрація речовини на поверхні, na і n0 - ефективні коефіцієнти заломлення адсорбованого шару і розчину відповідно, d - товщина адсорбованого шару і інкремент dn/dc складає ?0,19 см