РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Штами бактерій і бактеріофаги
В роботі були використані наступні штами бактерій:
А) Erwinia carotovora subsp. carotovora (Eсс):
1. RC5297. Даний штам є стійким до бактеріоцину Еса153;
2. RC5297Nalr - стійкий до налідиксової кислоти;
3. 62А – d1(ZF40с10)10/21 (10/21) – лізоген по фагу ZF40c10;
4. 62А – d1(ZF40)19 (lys19) – лізоген по фагу ZF40wt;
5. RC5297 (ZF40 wt)33 (lys33) – те ж;
6. RC5297 (ZF40 wt)16 – те ж;
7. RC5297(pKM101) - трансдуктант RC5297 з плазмідою pKM101;
8. RC5297Nalr (pKM101) - трансдуктант RC5297Nalr з плазмідою pKM101;
9. M2-4/50RI - спонтанний дисоціант Есс М2–4;
10. RC5297(pKM101) - транскон'югант RC5297 з плазмідою pKM101;
Б) Erwinia horticola
11. Erwinia horticola 450 – прототроф.
В) Escherichia coli:
12. С600 - множинний ауксотроф F-, supE44, Lac-, л s;
13. С600(Р1) - похідний від С600, який містить профаг Р1;
14. K12 – прототроф, F+, л;
15. BE – прототроф;
В) Salmonella typhimurium:
16. LT2 – прототроф;
Штами № 1, 2, 5, 6, 9 - 16 були отримані з музею відділу молекулярної генетики
бактеріофагів, Інституту мікробіології і вірусології НАН України.
Лізогени Eсс 62А–d1(с10)10/21 (10/21) і 62А – d1(ZF40)19 (lys19) були надані
автору А.І. Кушкіною (ІМВ НАНУ). Штами № 7 і 8 були отримані при виконанні
даної роботи.
Таблиця 2.1
Бактеріофаги, використані в роботі
Назва
Хазяїн
Походження
ZF40
Eсс RC5297
Наданий Ф.І. Товкачем (ІМВ НАНУ)
ZF40c3
Те ж
Наданий А.І. Кушкіною (ІМВ НАНУ)
ZF40c6
–– « ––
Те ж
ZF40c9
–– « ––
–– « ––
ZF40c10
–– « ––
–– « ––
ZF40с5/5
–– « ––
Отриманий в даній роботі
ZF40с1
–– « ––
Те ж
ZF40с1А3
–– « ––
–– « ––
ZF40сВ/3
–– « ––
–– « ––
ZF40с2/5
–– « ––
–– « ––
ZF40с6/5
–– « ––
–– « ––
ZF40с7/5
–– « ––
–– « ––
ZF40с8/5
–– « ––
–– « ––
ZF40/421
–– « ––
Наданий А.І. Кушкіною (ІМВ НАНУ)
ZF40с5/5/
М2-4/50RI
Eсс M2-4/50RI
Наданий Н.В. Черватюк (ІМВ НАНУ)
49
E. hoticola 450
Наданий Ф.І. Товкачем
FE44
E. coli НВ101
Те ж
E. coli С600
Музей відділу молекулярної генетики бактеріофагів, ІМВ НАН України
T7М
E. coli ВЕ
Те ж
Т4D
E. coli ВЕ
–– « ––
Р1Cmcts
E. coli С600
–– « ––
P22
S. typhimurium LT2
Наданий Ф.І. Товкачем
2.2. Поживні середовища, буферні розчини та хімічні реактиви
Для вирощування бактерій використовували рідкі та агаризовані поживні
середовища. Агаризовані середовища містили 1,4% агар-агару, напіврідкі поживні
середовища для титрування фагів – 0,5% агар-агару. Для відбору та клонування
трансдуктантів, а також перевірки їх здатності до росту та стабільного
успадкування антибіотикостійкості клонів використовували антибіотики в
концентраціях: ампіцилін – 50 мкг/мл та налідиксову кислоту – 20 мкг/мл.
Антибіотики в необхідній кількості додавали до агаризованих поживних середовищ
після їх стерилізації при 0,5 атм.
1. Середовище LB, г/л: триптон – 10, дріжджовий екстракт – 5, NaCl – 10 [81].
Середовище використовували для титрування і вирощування бактеріальних клітин,
титрування бактеріофагів, отримання фаголізатів, та проведення експериментів по
трансдукції.
2. Мінімальне середовище А, г/л: КН2РО4 – 10,5; К2НРО4 – 4,5; (NH4)2SO4 – 1,0;
натрію цитрат – 0,5. Після стерилізації додавали 1мл 1М розчину MgSO4 x7H2O та
джерело вуглецю (глюкоза або лактоза) в концентрації 0,2% [81]. Середовище
використовували для комплементаційного аналізу температурних clear-мутантів
фага ZF40 та отримання фаголізатів. Для титрування бактерій і бактеріофагів
використовували мінімальне середовище А без додавання Mg2+ і джерела вуглецю.
3. Мінімальне середовище М9, г/л: Na2HPO4 – 6; КН2РО4 – 3; NH4Cl – 1, NaCl –
0,5; Після його стерилізації додавали 1мл 1 М розчину MgSO4x7H2O. Як джерело
вуглецю використовували глюкозу або лактозу в кінцевій концентрації 0,2% -
0,8%. [81]. Середовище використовували для вирощування бактерій та
бактеріофагів. Розведення суспензій клітин та фагових лізатів для їх титрування
проводили в мінімальному середовищі М9 без додавання джерела вуглецю.
4. Напіврідкий (верхній) агар, готували на основі середовища LB з додаванням
0,5% агару, використовували при титруванні бактеріофагів.
Хімічні реактиви. В роботі використовувались хімічні реактиви вітчизняного
виробництва і виробництва фірми „SIGMA” і „Serva”.
В роботі використовували ендонуклеази рестрикції фірм „СибЭнзайм” (Росія),
„Biopor” (Росія), „Pharmacia” (Швеція), „Fermentas” (Литва). Ферменти зберігали
при температурі – 20 °С.
В роботі були використані наступні ендонуклеази рестрикції: HindIII, BglII,
SalI, PstI та BamHI.
Для ідентифікації кінцевих рестрикційних фрагментів використовували
екзонуклеазу III E. coli.
Стоп-буфер для рестрикії (x5): Na2ЕДТА – 0,1 мМ, бромфеноловий синій – 0,2 %,
фікол – 7%, [82].
Буфер РВ для виділення фагової ДНК: NaCl – 50 мМ; тріс-HCl – 50 мМ.
Тріс-фосфатний буфер для електрофоретичного розділення капсидних фагових
структур, фагової ДНК та рестрикційних фрагментів: 0,08 М тріс-фосфат, 0, 008 М
Na2ЕДТА [82].
Буфер Е для виділення та електрофоретичного розділення плазмідної ДНК:
тріс-ацетат (рН 7,9) – 40 мМ; Na2ЕДТА – 2 мМ [83].
Лізуючий буфер для виділення плазмідної ДНК: тріс-HCl – 50 мМ; SDS – 3 %; 2 M
NaOH до рН 12,6 [83]. Буфер зберігали при кімнатній температурі не більше 7
діб.
Буфери для зберігання фаголізатів: 1) STMG: NaCl – 200 мМ; тріс–HCl (рН 7,4) –
10 мМ; MgCl2 – 10 мМ; желатина – 100 мкг/мл [84].
2) STMF: NaCl – 200 мМ; тріс–HCl (рН 7,5) – 10 мМ; MgCl2 – 10 мМ; фікол – 4%
[85].
Всі буфери зберігали при 4 °С.
2.3. Методи досліджень
В роботі використовували адекватні вірусологічні, мікробіологічні,
молекулярно-біологічні, біохімічні та генетичні методи досліджень.
2.3.1. Одержання, концентрування фагових часток та визначення
- Київ+380960830922