ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования выполнены на 920 половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 150-200 г. В эксперименте использовались животные после прохождения карантина в условиях вивария ЛГМУ в течение 14 дней.
Опыты проводились согласно правил GLP [197,397,398] в рамках норм биоэтики (справка № 7/433 от 25.03.2003 г) в соответствии с методическими рекомендациями [52,118,139]. Животные получали стандартную диету в виде гранулированного корма по установленным нормам. Доступ крыс к воде был свободным. Забой осуществляли путем перерезания наружной и внутренней ветви сонной артерии под эфирным наркозом.
Экспериментальной моделью служил патологический процесс, развивающийся у животных в условиях замкнутого пространства. Моделирование гипоксии с гиперкапнией проводили путем помещения крыс в изолированные стеклянные гермообъемы (10 дм3) с экспозицией 45 минут.
Другую форму гипоксии - гипоксическую гипоксию на фоне гипертермии - моделировали в специально разработанной сотрудниками кафедры фармакологии ЛГМУ термокамере [146], в основу работы которой положен принцип вытеснения кислорода с помощью газообразного азота, подаваемого из стандартного баллона. При скорости подачи азота 10 л/мин в первую минуту экспозиции и в последующем со скоростью 0,4 л/мин содержание кислорода в камере составляло 10 об%. Контроль за содержанием кислорода и углекислоты проводили с использованием масс-спектрометра "МХ-6203". Температура воздуха в гермокамере составляла 42?С и поддерживалась автоматически с помощью реле, вмонтированных в ее стенки.
Первичный фармакологический скрининг потенциальных антигипоксантов проводили на двух моделях гипоксической гипоксии с гиперкапнией (с перегреванием и без него) среди 16 лекарственных препаратов с различными механизмами действия: пентоксифиллин, пирацетам ("Дарница", Киев), тиотриазолин ("Фарматрон", Запорожье), ацелизин ("Киевмедпрепарат", Киев), цитохром С, липин ("Биолек", Харьков), димексид ("Лубныфарм", Украина), силибор, фламин ("Здоровье", Харьков), кверцетин ("Борщаговский ХФЗ", Киев), натрия оксибутират ("Фармак", Киев), токоферола ацетат ("Киевский витаминный завод", Киев), берлитион ("Berlin-Chemie", Германия), нимотоп ("Bayer", Германия), эмоксипин ("Tallinna Farmaatsiatehas", Эстония), кислота никотиновая ("Merk", Германия). Кроме того, исследовали 8 оригинальных химических соединений в ряду производных 2,4-тиазолидиндионов, синтезированных на кафедре фармацевтической, органической и биоорганической химии химии Львовского государственного медицинского университета им Д. Галицкого кандидатом химических наук Р.Б. Лесиком (соединения Les-1-Les-4, Les-7, Les-8), и координационных соединений германия, синтезированных на кафедре общей химии и полимеров Одесского национального университета им. И.И. Мечникова проф. И.И. Сейфуллиной (субституенты МИГУ-1 и МИГУ-2).
Изучаемые лекарственные средства вводили однократно внутрибрюшинно за 60 минут до начала моделирования патологии. Каждая группа животных состояла из 6 крыс.
При выборе доз исследуемых препаратов, а также вводимых 1% растворов оригинальных химических соединений исходили из многочисленных данных литературы и многолетнего опыта работы сотрудников кафедры фармакологии ЛГМУ в области фармакологической коррекции экстремальных состояний гипоксического генеза [17,23,39,49,56,71,86,92,123,133,135,136].
Исходя из экспериментально установленной средней продолжительности жизни животных, подверженных воздействию гипоксии замкнутого пространства, в контрольной и опытной группах, для каждого потенциального антигипоксанта рассчитывали коэффициент противогипоксической защиты (Кз), а также относительный показатель увеличения времени жизни животных (П) [139]:
; , где
Топ - средняя продолжительность жизни животных в опытной группе;
Тк - средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе.
Крыс, подверженных воздействию гипоксической гипоксии с гиперкапнией на фоне температурного стресса, извлекали из камеры в конце 10 минуты экспозиции. При таком кислородном и температурном режимах гибель животных в контрольной группе (без введения препаратов и субституентов) составляла 87%.
Эффективность изучаемых потенциальных антигипоксантов оценивали по выживаемости (разность между процентами выживших крыс в опытной и контрольной группах) [134]:
Эффективность = ВЖоп - ВЖк , где
ВЖоп - выживаемость в опытной группе, %;
ВЖк - выживаемость в контрольной группе,%.
а также по течению клинической картины при исследуемой форме гипоксии (время появления тахипноэ, беспокойства, тремора, тризма, судорог, терминального дыхания) и срокам гибели.
Скрининговые исследования потенциальных антиоксидантов проводили на модели инициированного окисления метиловых эфиров ненасыщенных жирных кислот [265], источником которых служил "Линетол" (производства Одесского химико-фармацевтического объединения "Биостимулятор"). Молярное соотношение линетол/антиоксидант в инкубационной среде составляло 500:1 для всех исследуемых соединений. Пероксидацию линетола инициировали внесением в систему ионов двухвалентного железа в виде 1,04% водного раствора сульфата железа (II). Влияние исследуемых соединений на процессы ПОЛ оценивали по содержанию в системе продуктов липидпереокисления, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, в динамике (до внесения в систему ионов двухвалентного железа, а также через 20, 40, 60 минут после индукции ПОЛ) в сравнении с контролем (без внесения в инкубационную среду препаратов).
При разработке оптимального дозового режима МИГУ-1 вводили в виде 1% водной суспензии в различных дозах: 50; 75; 100; 150; 200 мг/кг за 60 минут до помещения крыс в гермообъем. Эффективность изучаемого германийорганического соединения оценивали по средней продолжительности жизни крыс в условиях гипоксии замкнутого пространства. Полученные экспериментальные данные интерполировали на многочлены Лагранжа, Ньютона, а также функции вида
- Київ+380960830922