РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти дослідження
Для дослідження модифікаційної дії ЕМВ НВЧ низької інтенсивності на рослини ми обрали об'єкти, на яких можливо було досліджувати радіобіологічні реакції диференційованих рослинних клітин - вищої водної рослини елодеї та твірних клітин, які мають велику проліферативну активність на прикладі проростків гороху.
2.1.1. Рух цитоплазми в клітинах вищої водної рослини Elodea сanadensis. Експерименти проводились на клітинах цілісних листочків вищої водної рослини родини Водокрасових (Hydrocharitacea) - Elodea сanadensis. Використовували акваріумну культуру цієї рослини, котра вирощувалась за умов денного освітлення при температурі 190 С на водопровідній воді. Вибір об'єкту був зумовлений особливостями клітинного метаболізму цитоплазми Elodea canadensis, а саме, ротаційним рухом її цитоплазми. Як вже згадувалося раніше, на відміну від інших типів руху, які спостерігаються в клітинах інших організмів - коливального, циркуляційного, фонтануючого - ротаційний рух відносно просто зафіксувати під мікроскопом за допомогою окуляр- мікрометру, секундоміра й отримати кількісні значення, які можна обчислити в стандартних одиницях виміру швидкості [21; 75; 108]. Цитоплазма в клітинах рухається вздовж бічних стінок з тою чи іншою постійною швидкістю, що уможливлює замірювати швидкість цього руху з достатньо високою точністю. Важливим для нас було й те, що ця рослина достатньо пристосована до широкого діапазону можливих змін рН середовища, а тому нескладно підтримувати її культуру. Як показник ротаційного руху використовували рух хлоропластів, котрі пересуваються по клітині.
Спостереження проводили на клітинах, які знаходяться поблизу центрального судинно-волокнистого пучка. Під час проведення експериментів для всіх варіантів опромінення і контролю зберігались однакові умови культивування. Як контроль використовували культуру, яка вирощувалась за тих самих умов, але не опромінювалась.
В експериментах використовували листочки, відокремлені від рослини. Процедура відокремлення листочків від пагону для рослини є стресом, який викликає тимчасове припинення руху цитоплазми в клітинах. Наші попередні дослідження показали, що відновлення руху цитоплазми відбувається приблизно через 40 хвилин після приготування препаратів. Тому після відокремлення листочків від пагону їх витримували при температурі 190 С протягом 30-60 хвилин, що виявилось достатнім для відновлення ротаційного руху цитоплазми.
На рис.2.1 показана залежність відновлення швидкості руху цитоплазми від часу після відокремлення листочка.
В усіх експериментах використовували листочки одного віку, які розташовані біля верхівки пагону, на однаковій відстані від точки росту гілочок, щоб виключити вплив різновікості листочків.
Швидкість руху цитоплазми в клітинах листочків Elodea canadensis вимірювали відразу ж після опромінення, або будь-якої іншої обробки і далі через кожну годину. Для цього використовували окуляр-мікрометр і реєструючи час за допомогою секундоміру встановлювали швидкість переміщення окремих хлоропластів в клітині, вздовж лінійних ділянок довгих бічних стінок клітин за методикою З. Штруггера [128]. Спостереження проводилися в прохідному світлі (мікроскоп NU, об'єктив 63, окуляр 15), швидкість руху хлоропластів розраховували за формулою:
V=l/t,
де V - швидкість руху, мкм/с; l - шлях, пройдений хлоропластом, мкм; t - час, с. Як вже було зазначено, ШРЦ - достатньо варіабельна величина і тому для зручності ми користувалися відносними одиницями, щоб виключити можливі зміни інтенсивності освітлення та температури протягом проведення експерименту. Відносні одиниці отримували як відношення значення ШРЦ дослідного варіанту до значення відповідного контрольного варіанту.
2.1.2. Визначення відносної швидкості росту клітин меристеми коренів гороху. Об'єктом дослідження модифікувальної дії ЕМВ НВЧ на твірні клітини рослин ми обрали п'ятиденні проростки гороху сорту Богатир. Насіння пророщували на фільтрувальному папері в умовах вологої камери при температурі 22-240 С в темноті. Проростки кожного варіанту вирощували в окремих посудинах по двадцять штук у кожному. Для кожного варіанту використовували три посудини. Після опромінення проростки вирощували в умовах водної культури на водопровідній воді при 22 - 230 С та природному освітленні протягом 16 днів пострадіаційного періоду. Для оцінки ступеня радіаційного пошкодження апікальної меристеми кореня використовували криві відносної швидкості росту (ВШР). Відносна швидкість росту є відношенням приросту опроміненого кореня за певний проміжок часу до приросту кореня контрольного (неопроміненого) варіанту за той же проміжок часу. В ході кривої ВШР відбиваються функціональні перебудови меристеми в пострадіаційний період, тому що опромінення в діапазоні доз, які ми використовували, не відбивається на розтягуванні клітин і ріст кореня в довжину визначається лише потоком клітин, які поступають з меристеми у зону розтягування. Значення ВШР визначається співвідношенням між потоками клітин, один з яких використовується для відновлення порушеної внаслідок опромінення структури меристематичної тканини, в той час як клітини іншого потоку переходять в зону розтягування.
Для побудови кривих ВШР приріст коренів вимірювали протягом 16 днів пострадіаційного періоду. Ріст головного кореня у проростках всіх варіантів вимірювали відразу ж після гамма-опромінення, а потім кожної доби в один і той же час за допомогою штангенциркуля та лінійки з точністю до одного міліметру. З появою бічних коренів останні видалялися.
2.2. Умови опромінення іонізуючою радіацією та ЕМВ НВЧ низької інтенсивності
Опромінення іонізуючою радіацією ізольованих листочків Elodea сanadensis. здійснювали на установці "Исследователь" з джерелом радіації 60Со, при потужності дози 0,068 - 0,050 Гр/с, в діапазоні доз від 25 до 4600 Гр. Опромінення проводили в умовах вологої камери, щоб виключити можливість підсихання лист