РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы, использованные в работе
В работе были использованы следующие материалы и реактивы: N-гидроксисукцинимидобиотин ("Sigma", США), авидин ("Sigma", США) авидин-алкалин фосфотаза ("Sigma", США), п-нитрофенил фосфат (pNPP) ("Sigma", США), кроличьи античеловеческие иммуноглобулины, конъюгированные с щелочной фосфатазой ("Sigma", США), эластаза ("Sigma", США), трис(гидроксиметил)аминометан, диизопропилфторфосфат ("Merck", Германия), контрикал ("Sigma", США), ?-казеин ("Sigma", США); хромогенный субстрат плазминa S2251, cтрептокиназа Kabikinase ("Pharmacia AG", Швеция), бычий сывороточный альбумин ("Sigma", США); маркеры молекулярной массы (Molecular Weight Calibration Kits - LMW, 14,400 - 94,000, "Pharmacia", Швеция), лизин сефароза, голубая сефароза CL 6B, сефадекс G-75, супероза 12, протеин А сефароза ("Pharmacia", Швеция). Неорганические соединения степени чистоты хч или выше отечественного производителя. Планшеты для ИФА ("Coster", США, "Nunc ", Nalge Nunc International, США).
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение плазминогена
Глу-форму плазминогена человека выделяли из свежеполученной цитратной плазмы донорской крови методом аффинной хроматографии на лизин-сефарозе в присутствии панкреатического ингибитора трипсина (,,Контрикал'', Германия) [146]. Для инактивации возможной примеси плазмина полученный белок обрабатывали в течение 2 часов при +20?С необратимым ингибитором сериновых протеиназ - 0,01 М диизопропилфторфосфатом.
Плазминоген подвергали гель-фильтрации на сефадексе G-150, уравновешенном 0,1 М гидрокарбонатом аммония, для удаления высоко- и низкомолекулярных примесей и ингибитора, лиофилизировали и хранили при +4?С. Все этапы проводили при +4? С для предотвращения преобразования Глу-плазминогена в Лиз-форму.
Препарат плазминогена быка получен на лизин-сефарозе [146] из цитратной плазмы быка в присутствии панкреатического ингибитора трипсина- контрикала с последующим диализом против 0,05 М трис-НCl буфера рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl.
Полученные препараты плазминогена имели потенциальную протеолитическую активность 19-22 казеинолитические единицы (к.е.) на 1 мг белка. Спонтанная активность не выявлялась ни казеинолитическим методом, ни при гидролизе хромогенного субстрата S2251. Чистоту полученных препаратов контролировали с помощью электрофореза в 10% ПААГ с ДС-Na и в 11,5% ПААГ с уксусной кислотой и мочевиной при рН 3,2 (Рис.2.1.).
2.2.2. Выделение фрагментов плазминогена
Фрагменты плазминогена: кринглы 1-3, крингл 4 и мини-плазминоген получали эластазным гидролизом Глу-плазминогена [6]. К плазминогену с концентрацией 10 мг/мл в 0,05 М трис-НCl буфере, рН 8,5, содержащем 0,1 М NaCl, добавляли эластазу в соотношении 78:1 и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 часов. Реакцию останавливали добавлением пара-нитрофенилгуанидинбензоата до концентрации 0,01 М. Гидролизат разделяли на колонке с сефадексом G-75, уравновешенной 0,05 М трис-НCl буфером, рН 8,5 на смесь: кринглы 1-3, мини-плазминоген, крингл 4. Кринглы 1-3 и мини-плазминогена разделяли на лизин-сефарозе, уравновешенной 0,05 М трис-НCl буфером, рН 8,5. Мини-плазминоген, неимеющий лизинсвязывающих участков, элюировали 0,05 М трис-НCl буфером, рН 8,5. Кринглы 1-3, содержащие лизинвязывающие участки, элюировали 0,05 М трис-НCl буфером, рН 8,5, содержащим 0.02 М 6-АГК.
Потенциальная протеолитическая активность полученных препаратов мини-плазминогена составляла 20-25 казеинолитических единиц (к.е.) на 1 мг белка. Спонтанная активность не выявлялась ни казеинолитическим методом, ни при гидролизе субстрата S2251. Препараты кринглов 1-3, крингла 4 и мини-плазминогена хранили в замороженном состоянии при -20?С.
Чистоту полученных препаратов контролировали электрофоретически в 10% ПААГ с ДС-Na [147]. Кринглы 1-3, крингл 4 и мини-плазминоген были электрофоретически гомогенные (Рис.2.2.).
2.2.3. Получение плазмина и мини-плазмина
Плазмин и мини-плазмин получали активацией соответствующих проферментов урокиназой, иммобилизованной на BrCN-активированной сефарозе 4В [149] со следующими модификациями. Урокиназ-сефароза была синтезирована согласно описанному фирмой Pharmacia методу [150]. 1 мг Глу- или мини-плазминогена инкубировали с 0,5 мл геля урокиназ-сефарозы (1250 МЕ/мл) в течение 1 час при +370 С в 0,05 М натрий фосфатном буфере, pH 7,4, который содержал 25% глицерол. При таких условиях степень преобразования плазминогена в плазмин составляет не меньше 95%. Эффективность активации оценивали по скорости гидролиза хромогенного субстрата S2251 или полимерного фибрина образующимся плазмином; казеинолитической активности в присутствии или в отсутствие стрептокиназы; данным электрофореза с ДС-Na в ПААГ в присутствии 2% ?-меркаптоэтанола. Казеинолитическая активность плазмина и мини-плазмина составляла 20-22 и 38-40 к.е./мг белка соответственно. Плазмин хранили в 0,05 М натрий фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 50% глицерол (по объему), при -100 С. Препараты плазмина были электрофоретически гомогенными (Рис.2.3.)
2.2.4. Определение активности плазмин(оген)а
Протеолитическую активность плазмина и потенциальную протеолитическую активность плазминогена определяли казеинолитическим методом [151], используя в качестве субстрата ?-казеин. Плазминоген, активируемый стрептокиназой (50 МЕ/мл) или плазмин в течение 30 мин при 37?С в трис-лизиновом буфере гидролизовали 4% казеин. Реакцию останавливали 15% трихлоруксусной кислотой. Ферментативную активность определяли спектрофотометрически при 280 нм по количеству растворимых тирозин-содержащих пептидов
Одна казеинолитическая единица соответствует такому количеству плазмин(оген)а, который за 30 мин в условиях опыта освобождает 450 мкг тирозин-содержащих пептидов, растворимых в 15% трихлоруксусной кислоте.
Амидазную активность плазмина или потенциальную амидазну