РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна характеристика спостережень.
Експерименти проводили на 73 кролях вагою 2,5-3,5 кг, з яких 10 тварин склали
контрольну групу (табл. 2.1).
Хронічну ішемічну хворобу серця відтворювали на 20 тваринах, за моделлю, що
поєднує вплив провідних патогенетичних чинників цього захворювання –
рецидивуючої коронарної недостатності і гіперхолестеринемії [146]. Для
досягнення даного ефекту та підтримки дисліпопротеїдемічного фону тварин
утримували на атерогенній дієті, додаючи щоденно в їжу 0,25 г/кг холестерину у
вигляді 0,25% суспензії на соняшниковій олії протягом 1 місяця [49]. Паралельно
виражений ангіоспастичний ефект ініціювали внутрішньовенним введенням
вазопресина у дозі 0,2-0,3 од/кг впродовж 1 місяця. Порушення ліпідного складу
сироватки крові контролювали, визначаючи вміст холестерину за Іlca і
тригліцеридів за Carlson, Ignatovska [136]. Біохімічні тести були проведені у
відділі біохімії Інституту кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска АМН України
(завідувач – проф. Л.С. Мхітарян).
Відповідно до завдань роботи, зокрема, вивчення особливостей корегуючого впливу
на порушений Са2+ метаболізм КМЦ при моделюванні хронічної ІХС препаратів
різних класів, які використовуються в клінічній практиці (антагоністів кальцію
і b-адреноблокаторів), були обрані фіноптин (Вепаміл, Верапаміл, Ізоптин,
Фалікард, Calan, Dilacoran, Isopine, Manidon, Vasolan) [103] виробництва “Оreon
Соrporachen” (Фінляндія) і обзидан (Анаприлін, Апо-пропранолол, Бетакеп,
Індерал, Пропранолол, Ново-пранол, Alindol, Bricoran, Cardinol, Deralin,
Inderal, Propral) [103] виробництва Isis Farms Gmbh, 08056 ZW Iska
(Німеччина).
Для визначення дії фіноптину й обзидану на міокард інтактних тварин препарати
вводили внутрішньоочеревинно протягом 1 місяця 1 раз на добу (по 10 тварин у
кожній групі). Дози препаратів не перевищували їхніх добових норм (фіноптин –
0,4 мкг/кг, обзидан – 250 мкг/кг) [103].
Морфофункціональні зміни міокарда при тривалому застосуванні фіноптину й
обзидану за умов хронічної коронарної недостатності та гіперхолестеринемії
(див. вище) досліджували відповідно на 11-ти і 12-ти тваринах. Препарати
вводили за 10-15 хвилин до ін’єкції вазопресину, так само і в тій же дозі, що й
інтактним тваринам.
Таблиця 2.1
Досліджуваний матеріал (n=73)
№ п/п
Групи експериментальних тварин
Кількість спостережень
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Контрольна
Введеня фіноптину інтактним тваринам
Введеня обзидану інтактним тваринам
Хронічна коронарна недостатність та атерогенна дисліпопротеїдемія
Тривале ведення фіноптину тваринам в умовах хронічної ішемічної хвороби серця
Тривале введення обкидану тваринам в умовах хронічної ішемічної хвороби серця
10
10
10
20
11
12
Всі експерименти й отримання матеріалу для подальших досліджень виконували з
використанням етаміналового наркозу (50,0 мг/кг) із дотриманням вимог гуманного
поводження з тваринами. Для того, щоб вийняти серце, наркотизованим кролям
розрізали грудну клітку і перикард. Потім у порожнину лівого шлуночка
працюючого серця через товсту голку вводили 4% водний розчин охолодженого до
00С параформа, який разом із кров’ю надходив у коронарні артерії. Така
“аутоперфузія” охолодженим розчином параформу забезпечувала швидку (за 5-8
секунд) зупинку серця, пригнічувала реактивність КМЦ, що призводило до їхньої
деформації при вирізанні шматочків тканини. Водночас, це не перешкоджало гісто-
і цитохімічним реакціям. Відразу ж після припинення скорочень серце виймали з
тушки тварини, клали на лід та розрізали гострим лезом на частини для подальших
досліджень. Зразки тканини міокарда лівого шлуночка брали за відповідною
методикою (О.С. Гавриш зі співавт., 1986) [163].
Морфофункціональний аналіз змін скоротливого міокарда, які обумовлені
порушеннями коронарного кровотоку, та ефективності фармакологічно активних
речовин, що застосовувалися для корекції цих змін, ґрунтувався на використанні
адекватно підібраного комплексу світлооптичних, електронномікроскопічних
методик та морфометрії (табл. 2.2).
2.2. Методи досліджень.
2.2.1. Гістологічне дослідження.
Для гістологічних досліджень використовували тканину міокарда, яку фіксували у
10% розчині нейтрального формаліну, зневоднювали в спиртах і заливали у
парафінові блоки. Гістотопограми серця забарвлювали гематоксиліном й еозином,
за методом Ван Гізон [108]. Для виявлення пошкоджень міокарда зрізи
забарвлювали гематоксиліном основним та фуксин-пікриновою сумішшю за методиками
Лі та Рего [272], залізним гематоксиліном за методом Гейденгайна [312], а також
досліджували фізикооптичним методом під інтерференційно-поляризаційним
мікроскопом МРІ-5 [92, 93, 108].
2.2.2. Трансмісійна електронна мікроскопія та гістохімія.
Зразки тканини лівого шлуночка серця швидко промивали охолодженим 0,1М
фосфатним буфером (рН 7,2-7,4), фіксували в ізотонічному 4% розчині параформа
на цьому ж буфері [46, 171, 229] і дофіксовували в ізотонічному забуференому 1%
розчині OsO4 з додаванням сахарози [70].
Після фіксування та зневоднення в спиртах зростаючої концентрації зразки
тканини просякали епоксидними смолами і заливали в блоки сумішшю епону та
аралдиту [70]. Спочатку отримували напівтонкі зрізи, які забарвлювали
метиленовим синім та основним фуксином і використовували їх для вибору місця
дослідження [169].
Ультратонкі зрізи отримували на приладі LKB-8800 (Швеція), контрастували їх
солями важких металів (ураніл-ацетат і цитрат свинцю) за Рейнольдсом.
Дослідження і фотографування об’єктів, підраховування ультраструктур КМЦ в
одному полі зору проводили під електронним мікроскопо
- Київ+380960830922