РОЗДІЛ 2
РЕАКТИВИ, ПРИЛАДИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Реактиви
У роботі використовували 3,3?,5,5?-тетраметилбензидин дигідрохлорид моногідрат,
х.ч. n-Фенетидину гідрохлорид, х.ч. Ацетилхоліну хлорид – ампули по 0,02 г,
х.ч. із комплекту реактивів польової хімічної лабораторії ПХЛ-54. Досліди
виконували при концентрації ацетилхоліну 3,3•10-4М у робочих розчинах. Препарат
холінестерази VI клас, активністю
28 АЕ/мг, фасована по 80 мг із комплекту реактивів автомобільної радіометричної
та хімічної лабораторії АЛ-4М. Решта реактивів були кваліфікації ч.д.а.
Концентрацію гідроген пероксиду встановлювали перманганатометрично [148].
2.2. Розчини
Усі розчини готували безпосередньо перед використанням на двічі дистильованій
воді.
Для проведення визначення ФОС за реакцією Шенеманна використовували стандартні
зразки розчинів пестицидів в ацетоні розфасовані у скляні ампули місткістю 3 мл
виробництва Спеціального конструкторсько-технологічного бюро з дослідним
виробництвом Фізико-хімічного інституту ім. Богатського НАН України. Робочі
розчини ХФ+ДДВФ співвідношенням 1:1 та хлорофосу чистоти 99,6% концентраціями
100 мкг/мл виготовляли ваговим методом шляхом розбавленням водою. Робочі
розчини метафосу та трихлорметафосу готували: вихідні ацетонові розчини
концентрацією 100 мкг/мл розбавляли ацетоном у 10 разів, з отриманих розчинів
брали аліквоту та розводили її водою у 10 разів — до кінцевих концентрацій 1
мкг/мл. Робочий розчин фозалону концентрацією 1 мкг/мл готували шляхом
розведення вихідного розчину ацетоном.
Для проведення визначення ФОС тощо ензимно-кінетичним методом з використанням
індикаторної реакції окиснення 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину використовували
інгібітори ферменту – стандартні зразки розчинів пестицидів в ацетоні. Робочі
розчини метафосу, трихлорметафосу, фталофосу та метилнітрофосу готували
розведенням у 10 разів стандартних зразків водою. Робочі розчини готували:
хлорофосу – точну наважку 0,05325 г розчиняли у 25 мл води; карбофосу: точну
наважку 0,24875 г розчиняли у 2000 мл води; дезоксипеганіну: розведенням 2,5 мг
(точна наважка) речовини у 1000 мл води; атропіну сульфату: розведенням у 100
мл води 0,0347 г (точна наважка) речовини. Робочий 10-6 М розчин тіонію
готували: розчиняли у 2000 мл води 0,0129 г речовини (точна наважка), з
отриманого розчину брали аліквоту і розводили її водою у 10 разів. Робочий 10-6
М розчин етонію готували: розчиняли у 2000 мл води 0,0117 г речовини (точна
наважка), з отриманого розчину брали аліквоту і розводили її водою у 10 разів.
Для визначення інгібіторів фермента ензимно-кінетичним методом з використанням
реакції окиснення п-фенетидину як індикаторної готували робочі розчини:
метафосу – розведенням водою стандартного розчину метафосу в ацетоні
концентрацією 100 мкг/мл до концентрації 10 мкг/мл; тіонію: 0,03225 г (точна
наважка) речовини розчиняли у колбі на 500 мл, доводили до мітки, потім брали
аліквоту і розводили її водою у 100 разів — отримували 10-6 М робочий розчин;
декаметоксину: 0,0694 г (точна наважка) речовини розчиняли у 100 мл води, потім
у 2 стадії розводили у 10000 разів — отримували 10-7 М робочий розчин;
дипразину: 0,01605 г (точна наважка) речовини розчиняли у колбі місткістю 500
мл, потім брали аліквоту і розводили її у 100 разів — отримували 10-6 М робочий
розчин; дезоксипеганіну: 0,0025 г (точна наважка) речовини розчиняли у 100 мл
води, потім брали аліквоту і розчиняли у 100 разів; 10-4 М розчин атропіну
сульфату: 0,0173 г (точна наважка) речовини розчиняли у 500 мл води.
Для підтримки необхідного рН використовували 0,1-0,2 М боратні, фосфатні
буферні розчини та 0,1 М розчин NaOH [148]. Спирт етиловий ректифікований
вищого очищення 96%.
Розведення 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину проводили у 40 % (об.) розчині етанолу
при температурі 40-45 0С впродовж 20-30 хв за активного перемішування
струшуванням. Причому, зниження чи збільшення концентрації етанолу призводило
до грудкування ТМБ і його подальше розчинення вимагало механічного
подрібнення.
2.3. Методи досліджень
2.3.1. Встановлення оптимальних умов проведення реакції Шенеманна з
використанням 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину
Під час визначення ФОС за реакцією Шенеманна для спостереження за швидкістю
реакції використовувався фотоелектроколориметричний метод контролю. Вимірювання
світлопоглинання здійснювали на КФК-2УХЛ-010 на світлофільтрі №3 (400 нм, l=2
см). Вимірювання проводили при 20 0С.
Досліджували вплив природи буферу та рН середовища. Виготовляли лужні, фосфатні
та боратні буфери з рН від 7 до 12 згідно припису [148]. Порядок змішування
реагентів був наступний: у пробірку вносили 4 мл 0,1 М розчину буферної суміші
відомої природи та йонної сили, додавали 2 мл водного розчину ХФ з розрахунку,
щоб кінцева концентрація у реакційній суміші становила 3 мкг/мл, перемішували
пробірку шляхом перевертання, далі додавали 1 мл 1 М гідроген пероксиду,
перемішували, далі додавали
1 мл 2Ч10-2 М 40% (об) водно-спиртового розчину ТМБ, доводили спиртом до
кінцевого об'єму 10 мл. Після перемішування переносили у кювету фотоколориметра
і визначали величину світлопоглинання через 5 хв. Паралельно в аналогічних
умовах ставили “холосту пробу” – у пробірку додавали рівну за об’ємом аліквоту
40% (об) водного розчину етанолу. На рис. 2.1. показані швидкості
некаталітичної та каталітичної реакції окиснення 3 мкг/мл ХФ в залежності від
природи буферу та його йонної сили.
Рис.2.1. Залежність величини світлопоглинання реакції окиснення ТМБ гідроген
пероксидом у присутності 3 мкг/мл ХФ (1,2,3) та його відсутності (4,5,6) у
лужному (1,4), фосфатному (2,5) та боратному (3,6) буферах. Ко
- Київ+380960830922