РОЗДІЛ II
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для рішення поставленої задачі проводили аналіз післяопераційного (n=452) та
секційного (n=20) матеріала, а також був виконаний експеримент на собаках
(n=16) та кролях (n=30).
2.1 Дослідження операційного матеріалу
Аналіз операційного матеріалу включав 452 жовчних міхура, видалених в плановому
порядку в Інституті хірургії та трансплантології АМН України.
Всього в групі хворих на ХКХ були досліджені жовчні міхури від 104 чоловіків
(23%) та 348 жінок (77%). Співвідношення захворюваності чоловіків та жінок
склало 1:3,3. Вік хворих коливався від 26 до 73 років і в середньому склав
48,2±1,6 років. Середній вік жінок був 47,7±2,1 років, середній вік чоловіків
дещо вищий - 49,1±1,3 років (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Розподіл хворих на хронічний калькульозний холецистит за віком та статтю
Вік (в роках)
До 30,
31-40,
41-50,
51-60,
61-70 і більше
ВСЬОГО:
Чоловіки
4,86
4,86
7,29
3,99
23
Жінки
7,97
11,94
28,1
23,01
5,98
77
ВСЬОГО:
12,83
16,8
35,39
27
7,98
100
Хворі мали в анамнезі типові для жовчнокам’яної хвороби скарги протягом 1-5
років (89,6%), а у 10,4% хворих був більш тривалий перебіг захворювання (8 і
більше років).
Групу контроля з 20 осіб, серед яких 8 чоловіків та 12 жінок (середній вік
58,5±4,2 років) склала вибірка жовчних міхурів, отриманих під час аутопсій
померлих, які не мали патології з боку біліарної системи, а причинами смерті
були розлади серцево-судинної системи.
2.1.1 Електронномікроскопічні та гістологічні методи дослідження
Підготовку матеріалу стінки жовчного міхура для електронної мікроскопії
проводили наступним чином. Біоптат фіксували в 2,5% розчині глютаральдегіду з
додатковою фіксацією 1,0% розчином чотирьохокису осмію (OsО4) на фосфатному
буфері (рН 7,2). Після відмивання, дегідратації в зростаючих концентраціях
етилового спирту (500-960) та абсолютному спирті і ацетоні, за традиційною
схемою біоптат заключали в суміш епоксидних смол Epon та Araldit M (виробництво
Fluca AG, Швейцарія). Отримані блоки різали на ультрамікротомі (LKB, Швеція)
для отримання “напівтонких” зрізів товщиною 3 мкм та фарбували азуром II. Після
аналізу матеріалу робили ультратонкі зрізи товщиною 20 нм, які попередньо
контрастували ураніл ацетатом та цитратом свинцю за загальновідомою методикою.
Отримані зрізи переглядали та фотографували на електронному мікроскопі JEM-100
S.
Гістологічну обробку клінічного матеріалу проводили за стандартною методикою.
Фрагменти стінки жовчного міхура з шийки, тіла та дна фіксували у нейтральному
формаліні, зневоднювали та заливали у парафін. Далі парафінові зрізи товщиною 7
мікронів забарвлювали гематоксиліном та еозіном, азуром II-еозином, за
Ван-Гізон, ставили ШИК-реакцію.
Фото гістологічних об’єктів отримані за допомогою цифрової відеокамери OLYMPUS,
яка з’єднана з мікроскопом та комп’ютером.
2.1.2 Морфометричні та статистичні методи дослідження
Для вирішення поставлених у роботі задач було відібрано 100 жовчних міхурів,
які були розподілені на 4 групи (по 25 однотипних випадків в кожній групі)
відповідно до класифікацій [23] та [45]. В цих групах був здійснений
морфометричний аналіз елементів будови стінки жовчного міхура, а саме проведено
вимірювання площі слизової та м’язової оболонок, площі поперечного перерізу
судин підсерозного сплетіння, площі та оптичної щільності покривного епітелію,
розмірів епітеліоцитів.
Отримані гістологічні матеріали вивчали за допомогою мікроскопу Jenaval
(Ziess), а також оцінювали морфометрично за допомогою аналізатора зображення
фірми “APBЕЛ” з використанням програмного забезпечення науково-виробничої
компанії “ЄВА”. Крім того, для морфометрії гістологічних об’єктів
використовували стандартну масштабну окулярну сітку на 256 квадратів або 289
вузлів і окулярний мікрометр. Виміри здійснювали при збільшенні окуляра 10,
об’єктива 8, 20, 40 в залежності від дослідного матеріалу.
Морфометрію виконували наступним чином. На рівній ділянці стінки жовчного
міхура, обмеженій рамками масштабної сітки, визначали площу слизової і м’язової
оболонок, а також площу поперечного перерізу судин. Останню підраховували на
площі половини масштабної сітки, тобто 146 вузлах. Вимірювання площі проводили
в умовних одиницях по відношенню до загальної площі сітки, а також в
мікрометрах, в 5 випадково обраних полях зору.
Морфометрію покривного епітелію виконували на відрізку базальної мембрани
довжиною 100 мкм, що дозволило в кожному окремому випадку оцінити розмір
епітеліоцитів, а також вивчити відповідність кількісних характеристик різних
елементів будови слизової оболонки. Значення площі епітелію наведені теж в
мікрометрах, а його оптична щільність в умовних одиницях, які є десятковим
логарифмом цього показника.
Паралельно морфометричним вимірам робили опис гістологічних препаратів.
Оскільки предметом дослідження були біологічні структури, нами був використаний
квантильно-ранговий класифікаційний метод, що найбільш адекватний для рішення
задач з оцінкою морфологічних об’єктів.
Для більш детального аналізу, враховуючи значний розкид значень, дані були
поділені на діапазони. Для цього була використана класифікаційно-діагностична
шкала оцінки біологічних ознак, а саме чотирьохкласна шкала (запропонована Б.С.
Шорниковим), яка дозволяє поділити початковий масив на 4 класи пропорційно
1:1:1:1 (або 25%, 25%, 25%, 25%). Оптимальне квантування значень дозволило
виділити межі певних числових інтервалів за ступенем їх вираженості. Це
означало, що 25% випадків у вибірці з найменшими даними склали групу А,
наступні 25% (помірні значення) віднесені до групи В, ще 25% (помірно-п
- Київ+380960830922