РОЗДІЛ 2
ОБ’ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика піддослідних тварин та моделі експерименту
Досліди виконані на білих статево дозрілих безпородних щурах-самцях масою тіла
150-180 г, які утримувалися на стандартному раціоні віварію. В процесі роботи
використано 126 тварин.
Токсичне ураження викликали шляхом одноразового внутрішньошлункового введення
тваринам водного розчину хлориду кадмію в дозi 6 мг/кг маси тіла [95], хлориду
свинцю в дозі 6,5 мг/кг (1/15 LD50) [40] та натрію нітриту в дозі 70 мг/кг (1/3
LD50) [39].
Піддослідних тварин поділили на такі групи: І – інтактні; ІІ – уражені хлоридом
кадмію; ІІІ – уражені хлоридом свинцю; ІV – уражені комбінацією хлориду кадмію
та хлориду свинцю; V – уражені комбінацією хлориду кадмію, хлориду свинцю та
нітриту натрію; VІ – уражені хлоридом кадмію, свинцю та нітритом натрію, яким
проводилась корекція гістидинатом міді; VІІ – уражені хлоридом кадмію, свинцю
та нітритом натрію, яким проводилась корекція гістидинатом міді та
ентеросорбентом “Фібросил”. Декапітацію під легким ефірним наркозом проводили
на першу, третю, та п’яту доби від моменту інтоксикації. Для дослідження
використовували цільну кров, плазму крові та тканину печінку.
З метою корекції викликаних порушень вводили гістидинат міді в дозі 0,98 мг/кг
внутрішньошлунково щоденно протягом всього терміну експерименту [40, 41]. При
цьому виходили з біотичної дози міді для білих щурів. При комбінованому
застосуванні гістидинату міді й ентеросорбента “Фібросил”, останній вводили з
розрахунку 1 г/кг маси тіла тварини.
Експерименти на тваринах проводили у відповідності з “Правилами використання
лабораторних експериментальних тварин”.
2.2. Дослідження стану антиоксидної активності
Визначення активностi ГПО. Активнiсть ГПО визначали за методом, описаним у
роботi [82]. До 0,3 мл плазми або гомогенату печiнки (1:4) додавали 0,5 мл
тріс-буферу (рН=7,4), молярна концентрація якого 0,25 ммоль•л-1, 0,1 мл
етилендиамінтетраацетату (ЕДТА), молярна концентрація якого 25 ммоль•л-1, 0,1
мл азиду натрiю, молярна концентрація якого 0,4 моль•л-1. Сумiш iнкубували 5 хв
за кiмнатної температури, потім додавали 0,3 мл розчину GSH, молярна
концентрація якого 50 моль•л-1. Реакцiю починали, додаючи 0,1 мл Н2О2, молярна
концентрація якого 50 моль•л-1. Через 1 хв реакцiю зупиняли 1 мл 10 % розчину
метафосфорної кислоти. Сумiш центрифугували i в центрифугатi визначали
кiлькiсть GSH. Активнiсть ферменту розраховували за рiзницею мiж кiлькiстю GSH
в контрольнiй (без Н2О2) i дослiднiй пробах i виражали в ммоль•хв-1·кг-1.
Визначення активності ГР. Активність ГР визначали за кількістю НАДФ•Н, що
витрачається у ферментативнiй реакцiї вiдновлення окисненого глутатiону [82].
Середовище, яке мiстило 0,4 мл 0,25 М тріс-буферу (рН=7,4), 0,1 мл 25 мМ ЕДТА,
0,1 мл 7,5 мМ НАДФН 0,5 мл 8 мМ окисненого глутатiону, iнкубували при
температурі 37 оС 10 хв, потiм вносили 0,1 мл плазми або гомогенату печiнки
(1:10) i сумiш знову iнкубували 10 хв при температурі 37 оС. Реакцiю зупиняли,
додаючи 2,8 мл охолодженого метанолу. Паралельно готували контрольну пробу, в
якiй гомогенат вносили пiсля метанолу. Проби центрифугували i в центрифугатi
спектрофотометрично при довжині хвилі 340 нм визначали кiлькiсть НАДФ·Н
(6,22•103•М-1•см-1). Ферментну активність розраховували за рiзницею мiж
кiлькiстю НАДФН у контрольнiй i дослiднiй пробах i виражали в ммолях
НАДФ·Н•хв-1•кг-1.
Визначення вмісту SH-груп. Принцип методу полягає в тому, що при взаємодiї
5,5'-дитiобiс(2-нiтробензойної)кислоти (реактив Елмана) з вiльними SН-групами
вiдбувається утворення тiонiтрофенильного анiону, кiлькiсть якого прямо
пропорцiйна вмiсту SН-груп [175].
До 0,2 мл кровi або гомогенату печiнки (1:10) додавали 1,6 мл 3 % Н2О2 i 0,2 мл
25 % cульфосалiцилової кислоти. Центрифугували 15 хв при 3000 об•хв-1, потiм до
0,5 мл центрифугату додавали 2,5 мл 0,2 М тріс-буферу (рН=8,4) i 0,05 мл 0,04 %
розчину реактиву Елмана. В контрольну пробiрку замiсть дослiджуваного матерiалу
вносили 0,2 мл води. Через 10 хв проби фотометрували на спектрофотометрi СФ-46
при 412 нм проти контролю. Концентрацiю SH-груп розраховували, виходячи з
коефiцiєнта молярної екстинкцiї для тiонiтрофенильного анiону, який дорiвнює
11400 М-1ґсм-1.
Визначення вмiсту ЦП у плазмi кровi. Рiвень ЦП визначали за методом, описаним у
роботі [75]. Принцип методу: окиснення п-фенiлендіамiну в присутностi
церулоплазмiну призводить до утворення забарвлених продуктiв. Кiлькiсть
церулоплазмiну пропорцiйна iнтенсивностi забарвлення.
Дослiдженню пiддавали плазму кровi без слiдiв гемолiзу. В пробiрки вносили по
0,1 мл плазми. В контрольну пробiрку додавали 1 мл 0,5 % розчину гiдроксиламiну
солянокислого з метою iнактивацiї ферменту. У всi пробiрки додавали по 8 мл
розчину ацетатного буферу (рН=5,5), молярна концентрація якого 0,4 моль•л-1 i
по 1 мл 1 % п-фенiлендиамiну. Пробiрки закривали корками i витримували в
термостатi при температурі 37 оС 1 год. Потiм у кожну пробiрку, крiм контролю,
додавали по 1 мл гiдроксиламiну солянокислого. Проби витримували 30 хв при
температурі 4 оС i потiм визначали їх оптичну щiльнiсть проти контролю на
спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 530 нм. Розрахунок проводили за
формулою:
С = ЕЧ875,
де С – концентрація ЦП в мг•л-1 плазми,
Е – екстинкцiя проби,
875 – коефіцієнт перерахунку.
2.3. Методи визначення окиснювальних процесiв в мiкросомах та показників
інтоксикації
Виділення мікросом печінки. Принцип методу ґрунтується на тому, що мікросоми,
будучи високозарядженими частинками, здатні утворювати агрегати при додаванні
іонів двохвалентних металів, так як останні нейтралізують нега
- Київ+380960830922