РАЗДЕЛ 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ
2.1. Методы исследования
В ходе выполнения работы было обследовано 106 больных СД типа 1 без признаков поражения почек и с различными стадиями ДН. Обследование проводилось в условиях эндокринологического и нефрологического отделений областной клинической больницы (ОКБ) и эндокринологического отделения городской клинической больницы №2 за период 2000-2002 гг. Лабораторные исследования проводились на базе клинической и биохимической лабораторий ОКБ, инструментальные исследования выполнялись в отделении функциональной диагностики ОКБ г. Харькова. Иммуноферментные исследования осуществлялись лабораторией иммунологии и патоморфологии института дерматологии и венерологии АМН Украины.
Клинический диагноз и стадии ДН устанавливались на основании тщательного клинического обследования больных: изучения анамнеза, объективных данных, лабораторных исследований (общие анализы крови и мочи, гликемический профиль, среднесуточная гликемия и глюкозурия, исследование мочи по Нечипоренко, определение микроальбуминурии, протеинурии, содержание мочевины и креатинина крови, электролитный баланс (К+, Na+ в сыворотке крови), содержание общего холестерина и общего белка в сыворотке крови). Проводилось ультразвуковое исследование почек, электрокардиография, оценивалось состояние сосудов глазного дна. Помимо общепринятых методов проводили комплекс иммуноферментных исследований: определение уровня ЭТ-1 в плазме крови и определение ФН в плазме крови и моче у исследуемых больных. Концентрацию ЭТ-1 определяли с помощью набора для иммуноферментного анализа (ИФА) Endothelin-1 ELISA system code RPN 228 фирмы Амершам (Великобритания) и миниколонок Amprep code RPN 1900/1902/1903/1904/1906 той же фирмы-производителя. Содержание ФН в крови и моче больных исследовали с помощью набора реагентов для иммуноферментного определения фибронектина (ИФА-Фн) - Москва, Россия.
В настоящее время существует несколько методов определения концентрации ЭТ-1 в биологической среде. Наиболее широко используемыми являются радиоиммунный метод и метод ИФА.
Набор материала для исследования содержания ЭТ-1 в крови проводился следующим образом: у обследуемых больных утром натощак в пробирку, содержащую стабилизатор (ЭДТА), забирали 5 мл крови, которую тут же немедленно центрифугировали, отбирали образцы плазмы и замораживали. Образцы плазмы хранились при температуре минус 20 С не более 3 месяцев.
Постановка ИФА: первый этап - подготовка проб с использованием колонок Amersham Pharmacia Biotech's Amprep 500 C2 (код RPN 1913). Колонки уравновешивались промыванием 2 мл метанола (для высокоэффективной жидкостной хроматографии) и 2 мл бидистиллированной воды.
Плазма (1 мл) подкислялась 0,25 мл 2 М НСL, центрифугировалась при 10000 g 5 минут при комнатной температуре и загружалась на колонку, которая промывалась 5 мл воды, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФА), а затем элюировалась 2 мл 80% метанола в воде. Элюат высушивался в токе воздуха и растворялся в 250 мкл буфера для анализа из тест-системы.
Второй этап - 100 мкл раствора вносили в лунки планшета и инкубировали в течение 3 часов при 4 С, после чего промывали буфером для промывания, вносили в лунки конъюгат моноклональных антител к эндотелинам с пероксидазой хрена: инкубировали 1 час, промывали и вносили субстратно-буферную смесь. После инкубации в течение 30 минут определяли оптическую плотность на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01с, №474, 1994 года выпуска, при 450 нм.
По калибровочной кривой находили содержание ЭТ-1 С-л в 100 мкл раствора, внесенного в лунки, и высчитывали содержание его в плазме С-пл (на 1 мл) по формуле:
С-пл = С-л х 10 / (фактор открытия) х (фактор концентрирования)
Фактор открытия был определен опытным путем проведением стандартного образца эндотелина через стадии очистки на колонке и концентрирования и составил 0,75.
Фактор концентрирования был равен отношению исходного (1 мл) и конечного объема (250 мкл) - 4.
Полученные результаты в fmol/ml для перевода в пг/мл умножали на 2,49.
Для количественного определения ФН в плазме крови методом ИФА использовался набор ИФА-Фн. В основе метода лежит высокоактивное связывание антител к ФН с полистиролом, в результате чего внутренняя поверхность лунок планшета приобретает свойства антительного сорбента, способного извлекать ФН из плазмы крови. Образовавшийся комплекс выявляется с помощью тех же по специфичности антител к ФН, конъюгированых с ферментом - пероксидазой из корня хрена. Далее ферментативная реакция регистрируется по изменению окраски субстратно-хромогенной смеси. Интенсивность окраски хромогена прямо пропорциональна концентрации ФН в исследуемом образце. Использование высокоочищенного препарата ФН обеспечивает высокую специфичность анализа. Минимальная концентрация ФН, определяемая с помощью набора, составляет не более 20,0 нг/мл. Коэффициент вариации результатов не превышает 8%. Диапазон определяемых концентраций ФН составляет 25,0-800,0 нг/мл.
Набор материала для определения содержания ФН в своротке крови производился у обследуемых утром натощак. В пробирку, содержащую цитрат забиралось 2 мл цельной крови, которая немедленно центрифугировалась, отбиралась плазма и замораживалась. Замороженные образцы хранились при температуре минус 20 С не более 20 суток.
Перед проведением анализа исследуемые образцы плазмы разводили в 1000 раз: к 0,01 мл исследуемой плазмы добавляли 0,99 мл 0,9 % раствора хлористого натрия, тщательно перемешивали. Затем к 0,1 мл разведенной плазмы добавляют 0,9 мл ФСБР.
Проведение анализа: набор извлечь из холодильника и выдержать при комнатной температуре не менее 30 минут. После этого отмывают планшет, для чего в каждую лунку вносят по 200 мкл отмывающего рабочего раствора твин-20. Процедуру отмывки повторяют 3 раза. Затем вносят в лунки планшета в дубликатах калибровочные пробы, контрольную плазму, исследуемые образцы крови. Вся п