РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Предметом исследований служили ооциты, 1-, 2-, 8-клеточные эмбрионы самок мышей 6-8 недельного возраста линии СВА. Осмотические реакции клеток исследовали в растворах хлористого натрия и растворах криопротекторов: этиленгликоля (ЭГ), 1,2-пропандиола (1,2-ПД), сахарозы.
В работе были использованы:
- метод световой микроскопии;
- метод криомикроскопии;
- физико-математическое моделирование процессов массопереноса;
- метод функциональной оценки жизнеспособности;
- метод волюмометрии;
- метод криоконсервирования эмбрионов с использованием быстрого замораживания.
Работа была выполнена на базе ИПКиК НАН Украины.
2.1. Характеристика предмета исследований
Характерной особенностью ооцитов млекопитающих является их большой размер в сравнении с другими типами клеток, низкая проницаемость для молекул воды, малое поверхностно- объемное отношение.
Для получения большого количества клеток использовался метод суперовуляции. Самкам проводили внутрибрюшинную инъекцию 5 МЕ гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) (Folligon, "Intervet", Holland) и 7,5 МЕ человеческого хорионического гонадотропина (чХГ) (Horulon, "Intervet", Holland) с интервалом 46-48 часов. Овуляция обычно происходит через 10-12 часов после введения чХГ. Для получения эмбрионов самок подсаживали к самцам той же линии для осеменения. День обнаружения копуляционной пробки считали первым днем беременности. Забой самок осуществляли дислокацией шейных позвонков. Ооциты и эмбрионы получали путем промывания отпрепарированных яйцеводов самок мышей физиологической средой Дюльбекко при комнатной температуре по стандартной методике [159]. Ооциты получали через 12-16 часов, а 1-, 2-, 8-клеточные эмбрионы - через 20-22, 48-50 и 72 часа соответственно после инъекции чХГ. Для удаления клеток кумулюса, в случае ооцитов и 1-клеточных эмбрионов, использовали кратковременную эквилибрацию клеток в растворе гиалуронидазы с концентрацией 0,1 мг/л, приготовленном на физиологической среде Дюльбекко. Полученные ооциты и эмбрионы трижды отмывали в среде Дюльбекко и сразу же использовали в эксперименте. Поиск и все манипуляции с яйцеклетками и эмбрионами проводили под микроскопом МБС-9 при 28-кратном увеличении. В экспериментах использовали клетки нормальные согласно временным параметрам развития и морфологической оценке [160], включающей целостность zona pellucida и цитоплазматической мембраны, прозрачность цитоплазмы, правильную форму бластомеров. Всего в работе было использовано около 2000 ооцитов и эмбрионов мыши. Эксперименты на животных проводили согласно правилам "Европейской конвенции защиты позвоночных животных, использующихся в экспериментальных и других научных целях" [161].
2.2. Приготовление растворов
В работе использовали растворы криопротекторов, широко применяемых в криоконсервировании ооцитов и эмбрионов млекопитающих: 0,5 и 1М сахарозы; 10, 20, 30% ЭГ и 10, 20, 30% 1,2-ПД, приготовленные в объемном соотношении на физиологической среде Дюльбекко, а также среды замораживания, содержащие 5,37 М ЭГ (4,2 М 1,2-ПД) и 1 М сахарозы. Все растворы были приготовлены из очищенных криопротекторов, предоставленных отделом криопротекторов ИПКиК НАН Украины. Для определения осмотически неактивного объема эмбрионов мыши использовали растворы хлористого натрия с концентрациями 0.15, 0.3, 0.5, 0.6М, приготовленные на тридистиллированной воде.
2.3. Криомикроскопические исследования внутриклеточного кристаллообразования в эмбрионах мыши
Криомикроскопические исследования были проведены на криомикроскопическом комплексе [162], созданном на базе светового микроскопа МБИ-15У (рис.2.1).
Рис. 2.1 Криомикроскопический комплекс.
Предметом криомикроскопических исследований служили 1- и 2-клеточные эмбрионы мыши.
Работа с изолированными клетками, такими, как эмбрионы мыши, сопряжена с определенными методическими трудностями. К ним относится сложность поиска одиночных клеток под микроскопом и толщина исследуемого образца, которая должна быть достаточно малой, чтобы было возможно наблюдать внутриклеточную кристаллизацию, и достаточно большой, для исключения деформации клеток покровным стеклом. Для устранения этих трудностей была сконструирована специальная ячейка, состоящая из покровного стекла, наклеянного на текстолитовую основу, с внутренним диаметром 1,5 мм (Рис.2.2). Поиск эмбриона, при помощи данной ячейки, был облегчен и ускорен, т.к. пространство, в которое помещали клетку, было достаточно малым. Во избежание высыхания раствора, ячейку накрывали покровным стеклом. Ячейку с объектом закрепляли в рабочей камере криоприставки к световому микроскопу.
Рис.2.2 Схема ячейки для криомикроскопических исследований процессов замораживания - оттаивания ооцитов и эмбрионов мыши.
Программное замораживание осуществляли в низкотемпературной приставке к световому микроскопу МБИ-15У. Контроль температуры объекта проводили по температуре в рабочей камере криоприставки. Кинетику процессов замораживания-оттаивания регистрировали фотографически. О наличии внутриклеточной кристаллизации судили по потемнению цитоплазмы эмбрионов.
Было проведено три серии экспериментов. В первой серии исследовали кристаллизационные процессы в незащищенных эмбрионах мыши, во второй - вероятность возникновения кристаллизации в зависимости от степени дегидратации 1-и 2-клеточных эмбрионов. Дегидратацию клеток проводили в гипертонических растворах сахарозы и хлористого натрия с концентрациями 0,5 М и 1 М, в течение 10 минут. После этого, клетки в малой капле исследуемого раствора помещали в ячейку, которую затем переносили в рабочую камеру криомикроскопа, где осуществляли охлаждение образца до температуры -30оС. В тертьей серии экспериментов 2-клеточные эмбрионы мыши, после предварительной 10 минутной эквилибрации в 10% растворе ЭГ, в течение 1,5 минут эквилибрировали