розділ 2.2.). Тобто
постулюється, що реальним субстратом АТР-гідролазної реакції є вільний
нуклеозидтрифосфат, а Mg2+ є активатором ферментативного перетворення.
Друга модель (“моноцентрова”) постулює існування одного центру для зв’язування
хелатного комплексу MgАТР2-, який і є субстратом реакції гідролізу.
При цьому було взято до уваги, що за фізіологічних значень рН Mg2+-залежна
АТР-гідролазна реакція протікає незалежно від рівноважної неферментативної
реакції хелатування нуклеозидтрифосфатом іонів Mg (Mg2++ATP4- = MgATP2-).
Результати проведеного нами кінетичного аналізу цих альтернативних моделей
вказують на те, що у випадку “біцентрової” моделі графік у координатах
{[Mg2+]/V0; [Mg2+]} має характеризуватися точкою мінімуму, а графічним
критерієм ідентифікації “моноцентрової” моделі у координатах {1/V0; 1/[Mg2+]2}
має бути пряма лінія.
З метою ідентифікації двох вищезазначених механізмів було досліджено
ферментативну активність “базальної” Mg2+-АТРази ПМ при зміні загальних
концентрацій АТР та Mg2+ в режимі еквімолярного співвідношення їх у середовищі
інкубації (за присутності 1 мМ ЕГТА відношення концентрації вільного АТР
(АТР4-) до концентрації вільного Mg (Mg2+) дорівнювало сталій величині – 1,25)
(рис.7).
Рис. 8. Тестування можливого механізму “базальної” Mg2+-залежної
АТР-гідролазної ферментативної реакції, який задовольняє “біцентровій” (а) та “
моноцентровій” (б) моделі реакції гідролізу АТР (M±m; n=5).
Перебудова одержаної концентраційної залежності (рис.7) у координатах
{[Mg2+]/V0;[Mg2+]} показує чітко виражений мінімум (рис.8, а), який задовольняє
графічному критерію кінетичної інтерпретації саме “біцентрової” моделі.
Навпаки, перебудова одержаної концентраційної залежності (рис.7) у координатах
{1/V0;1/[Mg2+]2} не демострує суто лінійної залежності, яка є графічним
критерієм “моноцентрової” моделі: одержаний графік (рис.8, б) є двофазним,
тобто нелінійним.
Отже, в результаті проведеного кінетичного аналізу запропонованих моделей
реакції ферментативного гідролізу АТР, що забезпечується “базальною”
Mg2+-АТРазою, показано, що ця реакція відбувається наймовірніше за механізмом,
який припускає наявність на ферменті двох окремих центрів зв’язування — для
АТР4- та іонів Mg.
Таким чином, у цій роботі нами було показано, що “базальна” Mg2+-АТРаза ПМ ГМК
матки, яка досить ефективно інгібується еозином Y (Кі=45,3 мкМ) та виявляє
чутливість до стимулюючої дії поліамінів, здатна до створення
транссарколемального протонного градієнта. Активність зазначеної АТРази
контролюється концентрацією протонів Н+ за принципом оберненого зв’язку. На
підставі аналізу вивчених кінетичних та каталітичних властивостей реакції
Mg2+-залежного “базального” ферментативного гідролізу АТР запропоновано модель
її можливого механізму (“біцентрова” модель). Згідно з даними літератури
[Костерин С.А., 1998] можливо, що “базальній” Mg2+-АТРазі сарколеми міометрія
належить важлива роль у здійсненні своєрідного функціонального зв’язку між ПМ
та мітохондріями, який опосередковується протонами та забезпечує протектування
мітохондрій від перевантаження іонами Са (завдяки Н+-Са2+ обміннику,
локалізованому у внутрішній мітохондріальній мембрані).
Висновки
1. Mg2+-залежним АТРазам належить фундаментальна роль у забезпеченні іонного
обміну через плазматичну мембрану. Цей обмін є одною з центральних ланок
механізму електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньких мязах.
Дослідження реакції “базального” Mg2+-залежного гідролізу АТР в плазматичній
мембрані є важливим для розуміння процесів регуляції іонного транспорту в цій
структурі. У дослідах, виконаних на обробленій розчином дигітоніну фракції
плазматичних мембран гладеньком’язових клітин матки свиней, проведено
комплексне дослідження кінетичних та каталітичних властивостей реакції
“базального” Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР, її причетності до
створення транссарколемального протонного градієнта, чутливості до дії деяких
ефекторів (інгібітори, поліаміни). Запропоновано кінетичну модель можливого
механізму цієї реакції.
2. Із використанням специфічних інгібіторів Mg2+-залежних АТР-гідролаз,
флуоресцентного зонду 9-аміноакридину, дигітоніну та протонофору СССР
продемонстровано, що “базальна” Mg2+-АТРаза сарколеми (питома ферментативна
активність – 11,8 ± 1,2 мкмоль Рі/мг білка за год) здатна забезпечувати
створення трансмембранного протонного градієнта.
3. Доведено, що кінетика Mg2+-залежного ферментативного гідролізу АТР в
діапазоні часу до 10 хв підпорядковується закономірностям хімічної реакції
нульового порядку (значення початкової швидкості V0 становить 250±30 нмоль
Рі/мг білка за хв). Величини оптимальних концентрацій іонів Mg та АТР
становлять 0,5-3 та 0,3-1 мМ відповідно. Значення константи активації іонами Mg
KMg та константи Міхаеліса Km за АТР дорівнюють 286,7±27,6 та 48,5±8,0 мкМ
відповідно, а величини початковоої максимальної швидкості гідролізу за Mg2+ VMg
та за АТР VATP складають 34,6±4,3 та 33,1±4,8 мкмоль Рі/мг білка за год
відповідно.
4. “Базальна” Mg2+-АТРазна активність не є специфічною до АТР (також
гідролізуються CTP, GTP, UTP) та до катіона-активатора (гідроліз АТР має місце
не лише у присутності Mg2+, але й у присутності Ca2+, Co2+, Mn2+). Ізотонічна
заміна катіонів Na на катіони K, Li, Rb, холін (у разі використання хлоридів)
або на ізотонічну сахарозу, аніонів Cl на аніони Br чи I (у разі використання
калієвих солей) практично не впливає на Mg2+-АТРазну активність. Активація
“базальної“ АТРази