<p>РОЗДІЛ 2 <br />МЕТОДИ ТА МАТЕРІАЛИ ДОСЛІДЖЕННЯ<br />2.1. Об'єкти та моделі дослідження<br />Експериментальну частину виконано на 272 щурах - самцях лінії Вістар масою<br />180–200 г, одержаних з розплідника ІФТ АМН України в осінньо-зимовий період.<br />Під час проведення експерименту всі тварини знаходилися на стандартному раціоні<br />живлення віварію згідно з “Санітарними правилами по устаткуванню, обладнанню та<br />утриманню експериментально-біологічних клінік (віваріїв)” [94]. Для вибору<br />достатнього для статистичних висновків об’єму вибірок у пакеті «Biostat» було<br />проведено оцінку чисельності груп порівняння для рівня значущості p=0,05 та<br />оперативної характеристиці тесту b=0,2. Рекомендований об’єм вибірки для кожної<br />групи порівняння у цьому випадку n=6 (розрахунки велися у припущенні, що<br />різниця між середніми значеннями перевищує середньоквадратичне відхилення у 2<br />рази). З урахуванням необхідності проведення множинних порівнянь було обрано<br />кількість тварин у кожній експериментальній серії, n=8. <br />Експериментальні та контрольні групи щурів складалися з урахуванням віку, маси<br />та статі тварин. Однойменні втручання завжди виконувалися в один і той самий<br />час доби. При проведенні кожної серії експериментів одночасно досліджувалася і<br />контрольна група тварин (табл. 2.1). <br />Відповідно до плану досліджень, використовувалися загальноприйняті моделі<br />експериментальних порушень еритропоезу. Гіпоксичну гіпоксію відтворювали шляхом<br />двократного 18-годинного утримання тварин у барокамері при атмосферному тиску<br />0,4 атм [223]. <br />Двопроцентну, від маси тіла, крововтрату викликали шляхом забору крові із<br />стегнової вени тварин. Операція виконувалася під внутрішньочеревним<br />тіопенталовим наркозом (40 мг/кг маси). <br />Таблиця 2.1<br />Серії запланованих експериментів за темою дисертаційної роботи<br />Методика<br />Експериментальна серія<br />Кіль-кість тварин<br />Визначення продуктів ВРО та ферментів антиоксидантного захисту в нирковій<br />тканині <br />контроль<br />контроль+серотонін<br />гіпоксична гіпоксія<br />гіпоксія+серотонін<br />крововтрата<br />еритроцитоз<br />8+18<br />Визначення концентрації серотоніну в плазмі крові<br />контроль<br />крововтрата<br />спленектомія<br />спленектомія+еритроцитозом<br />селез.з блок.деп.функ.+еритроцитоз<br />еритроцитоз<br />8+18<br />Визначення серотоніну в нирковій тканині<br />контроль<br />спленектомія<br />спленектомія+еритроцитозом<br />селез. з блок.деп.функ.+еритроцитоз<br />еритроцитоз<br />8+18<br />Ферментативне визначення АОА в нирковій тканині<br />контроль<br />контроль+серотонін<br />гіпоксична гіпоксія<br />гіпоксія+серотонін<br />Підрахунок ЕО у кістковому мозку<br />контроль<br />гіпоксична гіпоксія<br />крововтрата<br />еритроцитоз<br />8+18<br />Поліцитемію відтворювали шляхом двократного введення у черевну порожнину щурів<br />80 % еритроцитарної суспензії (об’ємом по 4,0 мл), яку отримували після<br />триразового відмивання венозної крові тварин фізіологічним розчином [87, 62].<br />Тварини виводилися з експерименту вранці під тіопенталовим наркозом. <br />2.2. Методики дослідження системи еритрону<br />Кров для дослідження забиралася з хвостової вени тварини.<br />При цьому концентрацію еритроцитів, показники гематокриту, рівень гемоглобіну<br />визначали за стандартними уніфікованими методиками. <br />Відносну кількість ретикулоцитів, у відсотках, підраховували в мазках крові,<br />забарвлених діамантовим крезиловим синім, з подальшим перерахунком абсолютного<br />складу на 1000 еритроцитів. <br />Морфологію еритроїдних елементів кісткового мозку тварин досліджували методом<br />виділення ЕО кісткового мозку, модифікованим Ю.М. Захаровим та І.Ю.<br />Мельниковим, що дало змогу визначити кількісний і якісний склад еритроїдних<br />елементів [35]. При вивченні еволюційних змін клітинного складу еритроїдних<br />елементів за ступенями зрілості орієнтувалися на кількісну і морфологічну<br />характеристику еритробластів у ЕО. Так, еритроїдні острівці першого класу (ЕО1)<br />містять до 8 еритробластів (унаслідок подвоєння клітин 2:4:8); еритроїдні<br />острівці другого класу (ЕО2) – від 9 до 16 ядроутримуючих еритроїдних клітин<br />(унаслідок подвоєння клітин 8:12); еритроїдні острівці третього класу (ЕО3) –<br />від 17 до 32 нормобластів (унаслідок подвоєння клітин 16:32); «інволюціюючі»<br />еритроїдні острівці (ЕОінв) містять менше ніж 16 ортохромних нормобластів і<br />ретикулоцитів; «реконструюючі» еритроїдні острівці (ЕОрек) разом з оксифільними<br />нормобластами мають проеритробласти та базофільні еритробласти. <br />2.3. Біохімічні методи дослідження<br />Використані в експериментальній частині роботи методи підготовки біологічного<br />матеріалу до біохімічних досліджень проводилися за стандартними методиками<br />[66]. <br />Усі процедури з виділення субклітинних фракцій тканин виконувалися на холоді,<br />при температурі повітря лабораторного приміщення від 0 до +4 °С. Інструменти<br />для дослідів були також охолодженими. <br />На першому етапі роботи нирки забитих тварин ретельно відмивалися від крові,<br />обполіскувалися кілька разів в охолодженому 0,9 %-вому розчині KCl і<br />обсушувалися фільтрувальним папером. Після цього виділений орган поміщали в<br />чашку Петрі, розташовану на льоду, ножицями видаляли судини, залишки сполучної<br />тканини і жиру, згустки крові. Нирки ще раз обполіскували охолодженим 0,9 %-вим<br />розчином KCl і ретельно відділяли кіркову речовину органу від мозкової. <br />Гомогенізацію подрібненої ниркової тканини проводили також на льоду, доводячи<br />кінцеве розбавлення гомогенату 0,145 М розчином до співвідношення 1:9. <br />На другому етапі дослідження оцінювали активність ПОЛ у нирках за накопиченням<br />його продуктів у тканині [2]. Для цього спочатку гомогенат екстрагували у 5,0<br />мл суміші гептан-ізопропанолу (3:7 за об'ємом). Для досягнення оптимальних<br />значень оптичної густини дослідного матеріалу додавали 2,0 мл водного розчину<br />соляної кислоти (HCl) (рН дорівнював 2), добре перемішували і піс</p>
- Київ+380960830922