Розділ 2
Структурна біологія тубулінів тварин,
грибів та рослин
Як видно з даних, викладених в попередньому розділі, тубуліни є білками, які
завдяки своїм функціям фактично забезпечують структурну організацію
внутрішнього простору еукаріотичної клітини. З цього факту витікає, що саме
детальне знання принципів просторової організації молекул тубуліну є ключовим
фактором для розуміння їх функціональних особливостей. Зрозумілим стає і
інтерес дослідників до проблематики відтворення просторової структури молекул
тубуліну – як за допомогою кристалографічних, так і за допомогою комп`ютерних
(in silico) методів.
2.1 Кристалографічні дослідження тубулінів тварин
Кристалізація молекул тубулінів пов`язана з певними труднощами, що обумовлені
здатністю цих білків утворювати надмолекулярні комплекси, тобто здатністю до
олігомеризації. Відомо, що білкові комплекси взагалі (і мікротрубочки та ЦОМТи
зокрема) не мають властивих кристалам періодичних повторів структури в трьох
напрямках. Це означає, що в своєму нативному стані тубуліни взагалі не здатні
до утворення кристалічної ґратки. На відміну від олігомеризуємих білків
білки-мономери не лише здатні до кристалізації в нативному стані, але й у
більшості випадків зберігають свої функції. Таким чином, для отримання
кристалів тубулінів було необхідно підібрати досить жорсткі умови, що могли б
певним чином змінити орієнтацію відповідних поверхневих груп молекул тубулінів,
зокрема тих, які відповідають за утворення латеральних контактів в
мікротрубочках. Також слід зауважити, що навіть при проведенні
експериментальних досліджень структури тубулінів методи комп`ютерного
моделювання використовувалися дуже широко.
Той факт, що високоочищений тваринний тубулін в присутності високих
концентрацій іонів цинку здатний до полімеризації в двомірні пластинки, був
відомий давно, ще з 1976 року [[civ]]. Але пластинки, цілком придатні для
аналізу за допомогою електронної кристалографії, були отримані лише в 1995 році
[[cv]]. У цих пластинках тубулінові протофіламенти подібні до протофіламентів в
мікротрубочках, але асоційовані антипаралельно. Цинк-індуковані тубулінові
пластинки є холодочутливими і потребують ГТФ для своєї збірки так само, як і
нативні мікротрубочки. Додавання таксолу стабілізує пластинки так само як
мікротрубочки, і зокрема є ефективним проти низькотемпературної
деполімеризації.
Отримані пластинки було проаналізовано за допомогою електронної кристалографії
при низькому розділенні – 6,5 A [[cvi]] та 4 A [[cvii]]. В цих дослідженнях
було показано, що структури протофіламента в мікротрубочці та в
цинк-індукованій пластинці відповідають одна одній.
Аналіз кристалів тубуліну при розділенні 3,7 A дав змогу побудувати модель
просторової структури молекул a- та b-тубуліну на атомарному рівні [9]. Моделі
побудовані на основі 93 електронно-дифракційних зразків та 153 зображень і не
містять інформації про просторову структуру останніх 10 та 18 амінокислотних
залишків молекул a- та b-тубуліну відповідно. Карти електронної густини для a-
та b-тубулінів дуже подібні. Різниця між ними обмежується довжиною та
конформацією деяких петель, слабким зміщенням елементів вторинної структури і
відмінностями в густини бічних ланцюгів. Ядро структури молекул тубуліну
містить b-шари з 6 та 4 елементів, оточені 12 a-спіралями.
За наведеними даними (рис. 2.1), молекула тубуліну являє собою досить щільну
глобулу, яка не підрозділяється на структурні домени. Незважаючи на це,
дослідники наполягають на виділенні в кожному мономері тубуліну трьох
послідовних функціональних доменів. N-кінцевий домен (регіон) включає залишки
1-205 і утворює згортку Росмана, типову для нуклеотид-зв’язуючих білків, в якій
паралельні b-смуги перемежовуються з a-спіралями. Спіралі Н1 та Н2 знаходяться
з одного боку b-шару, а H3, Н4 та Н5 відповідно – з іншого. Смуги В2 та В3 за
картою електронної густини визначаються слабко. Залишки в петлях, що з’єднують
Н1 та В2, а також Н2 та В3, включено в модель для повноти останньої, але вони
також визначені за дуже слабкою густиною. Ці сегменти відповідають
варіабельному регіону послідовності тубулінів і знаходяться на молекулярній
поверхні, що орієнтована всередину мікротрубочки [54].
Рис. 2.1 Просторова структура ab-димеру тубуліну тваринного походження (за
[9]).
Серединний домен, що починається смугою В6, охоплює залишки 206-381 та містить
b-шар, оточений 5 спіральними елементами. Довга петля між Н7 та Н8, а також
сама спіраль Н8 розташовані на поверхні повздовжнього контакту між тубуліновими
мономерами. Смуга В7 взаємодіє з b-шаром N-кінцевого домену. Петля між В7 і Н9
більш впорядкована в молекулі a-тубуліну, де вона залучена до утворення тісних
латеральних (бічних) контактів. Наступна велика петля доходить до елементів В8
та Н10, які розплутують її С-кінець в a-тубуліні, за нею розташовується
коротенька, чітко визначена петля до В9. Нарешті, петля між В9 та В10 у
a-тубуліну містить вставку з 8 амінокислотних залишків, яка щільно замикає сайт
на поверхні молекули b-тубуліну, що є місцем посадки молекули таксолу.
(Представлена модель сумісна зі спостереженнями, що С241 та С356 можуть бути
перехресно зв’язані – приблизно 8 А різниці).
С-кінцевий домен a- і b-тубулінів утворено спіралями Н11 та Н12. Вони
накривають попередній домен, розташовуючись на поверхні молекули, що
ідентифіковано як зовнішню поверхню мікротрубочки [107, [cviii]], яка
найімовірніше залучена у взаємодію з БАМами та моторними білками. Петля, що
поєднує Н11 та Н12, є важливою для взаємодії з наступним по ходу протофіламе
- Київ+380960830922