РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Рослинний матеріал
Рослинним матеріалом для виділення хлоропластів слугували листки двотижневих
рослин гороху посівного (Pisum sativum L.) сорту “Дамір-2”, насіння якого було
отримане з Київського Інституту землеробства (Україна), а також листки
40-денних рослин шпинату (Spinacia oleracea L.), придбаних у торговій мережі.
Рослини гороху вирощували за лабораторних умов.
Насіння гороху інкубували в дистильованій воді протягом 24 годин у термостаті
при 250 С. Рослини вирощували в скляних пробірках на фільтрувальному папері на
середовищі Кнопа 14 діб за температури 22-240 С та фотоперіоду 14 годин. В
якості джерела освітлення використовували люмінесцентні лампи ЛБ-40 (Полтава,
Україна) з інтенсивністю світлового потоку 140 мкмоль·м-2·с-1. Щільність потоку
фотонів на рівні рослин визначали за допомогою сферичного мікроквантового
сенсора US-SOS та вимірювального пристрою LI-COR (LI-250, США).
2.2. Препаративні методи
2.2.1. Виділення хлоропластів класу “B”. Хлоропласти класу “B” зберігають
незруйновану систему внутрішніх (тилакоїдних) мембран з морфологічно, але не
функціонально інтактною оболонкою [89]. Їх виділяли згідно методу Волкера
[196].
Листки рослин промивали в дистильованій воді та витримували у холодильнику при
4-60 С протягом 2-3 годин. Потім листки гомогенізували за допомогою блендера
(Braun-250W, Німеччина) протягом 20 с в попередньо замороженому до появи
кристаликів льоду середовищі, яке містило 400 мМ сорбітол, 10 мМ NaCl, 10 мМ
трис-HCl (pН 7,80) і 5 мМ аскорбат натрію. Аскорбат натрію, доданий для
стабільності виділених хлоропластів, готували безпосередньо перед експериментом
шляхом змішування еквімолярних розчинів аскорбінової кислоти та гідрокарбонату
натрію. Для гомогенізації 100 г листків використовували 300 мл середовища.
Гомогенат фільтрували через 2 шари полотняної тканини та осаджували на
центрифузі К-24D при 3 500 g протягом 7 хвилин. Осад ресуспендували в
середовищі гомогенізації і центрифугували 2 хвилини при 500 g для видалення
агрегатів та фрагментів клітинної стінки. Одержаний супернатант центрифугували
протягом 7 хвилин при 3 500 g. Осад хлоропластів суспендували в середовищі
зберігання, яке містило 400 мМ сорбітол, 10 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl
(pН 7,80), 2,5 мМ MgCl2, та зберігали у темряві при 1-20 С. Концентрацію
хлорофілу визначали за методом Арнона [24].
2.2.2. Одержання препарату тилакоїдних мембран, звільнених від каталітичної
частини АТФ-синтази (СF1) [116, 149]. Розчин 5 мМ NaBr додавали до тилакоїдних
мембран, що були суспендовані в середовищі, яке містило 400 мМ сахарозу, 10 мМ
NaCl, 5 мМ дитіотрейтол (ДТТ) і 10 мМ трицин-NaOH (рН 8,00), таким чином, щоб
його кінцева концентрація складала 2 М, а концентрація хлорофілу в препараті –
1 мг/мл. Після інкубації протягом 30 хвилин при 00 С до реакційної суміші
додавали рівний об'єм дистильованої води і суспензію центрифугували при 20 000
g протягом 10 хвилин. Осад суспендували в 10 мМ трицині-NaOH (pН 8,00) при
10-кратному розведенні початкового об'єму за допомогою скляно-тефлонового
гомогенізатора і центрифугували протягом 10 хвилин при 20 000 g. Кінцевий осад
гомогенізували в середовищі, яке містило 400 мМ сахарозу, 10 мМ NaCl, 5 мМ ДТТ
і 10 мМ трицин-NaOH (рН 8,00) до концентрації хлорофілу 2 мг/мл.
2.2.3. Одержання тіол-модульованих тилакоїдів [140]. Мембраноз'язаний комплекс
СF0CF1 існує в двох формах в залежності від редокс-стану його тіолових груп
[86]. Гідроліз АТФ каталізує лише форма з відновленими тіоловими групами, у
зв'язку з чим гідролітична активність ферменту може бути визначена тільки після
приведення його у відновлену форму [139].
До 0,15 мл суспензії хлоропластів (2 мг хл./мл) додавали 0,85 мл середовища,
яке містило 6 мМ MgCl2, 24 мМ KCl, 10 мМ ДТТ, 0,12 мМ метилвіологен, каталазу
(750 од.·мл-1) і 30 мМ трицин-NaOH (pН 8,00). Каталазу вносили в середовище
безпосередньо перед експериментом. Після інкубації протягом 30 с до суспензії
додавали 0,2 мл 2 М сорбітолу таким чином, щоб його кінцева концентрація
складала 0,33 М, а концентрація хлорофілу – 0,25 мг/мл.
Суспензію освітлювали білим світлом зі щільністю потоку фотонів 250
мкмоль·м-2·с-1 протягом 6 хвилин за температури 16-200 С. Відновлені тилакоїди
зберігали при 1-20 С і використовували протягом 30 хвилин після обробки. В
якості джерела освітлення використовували лампу КГМ потужністю 150 Вт, світло
якої пропускали через фокусуючу систему, що складалась із круглодонної колби
(100 мл), заповненої 1%-ним розчином СuSO4·H2O.
2.2.4. Одержання препаратів тилакоїдних мембран, оброблених ДЦКД. Хлоропласти
обробляли ДЦКД, який був розчинений в етанолі або діетиловому ефірі. Тилакоїдні
мембрани інкубували з ДЦКД при вказаних в експериментах концентраціях та
співвідношеннях ДЦКД/хлорофіл (концентрація етанолу не перевищувала 0,2%). У
контрольний зразок вносили еквівалентну кількість розчинника. Спеціально
проведені експерименти показали, що етанол у концентраціях до 0,5% не впливає
на швидкість електронного транспорту і фотофосфорилювання, тоді як у вищих
концентраціях він інгібує ці процеси [5]. Після інкубації хлоропластів з
розчином ДЦКД в етанолі протягом зазначеного в експериментах часу мембрани
осаджували і суспендували в середовищі зберігання з бичачим сироватковим
альбуміном (БСА) в концентрації 1 мг/мл. Потім зразки двічі переосаджували,
промиваючи осади середовищем без БСА. Одержані препарати зберігали при 1-20 С.
При використанні для обробки хлоропластів ДЦКД в діетиловому ефірі спочатку
розчин інгібітора в ефірі у розрахованій концентрації вносили в чисту суху
склянку, яку переносили
- Київ+380960830922