РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Серії і об`єм експериментальних досліджень
Експериментальні дослідження були проведені на 280 безпорідних щурах-самцях і
поділені на дві експериментальні групи за віком: 6 - 10 місяців – дорослі, 24 -
28 місяців – старі (табл. 2.1).
Таблиця 2.1.
Основні показники, які визначались в плазмі крові та судинній стінці
Показники
Дорослі, 6 - 10 місяців
Старі, 24 - 28 місяців
Продукти
ліпопероксидації
п = 20
п = 20
Ліпопротеїни
атерогенних класів
п = 20
п = 20
Жирнокислотний склад
п = 20
п = 20
Рівень стабільних
метаболітів NO
п = 20
п = 20
Активність
конститутивної NО-синтази
п = 20
п = 20
Активність
індуцибельної NO-синтази
п = 20
п =20
Активність аргінази
п = 20
п = 20
Загальна кількість тварин
п = 140
п = 140
Експериментальна частина роботи виконувалася у відповідності до Правил
проведення робіт з експериментальними тваринами, які були затверджені Наказом
МЗ СРСР №755 від 12.08.1977р. та етичним кодексом Ради міжнародних
медико-наукових товариств по проведенню експерименту з використанням тварин
[198].
Перша серія досліджень присвячена вивченню вікових змін в судинній стінці
продуктів ліпідної пероксидації, жирнокислотного складу гладком`язевих клітин,
рівень стабільних метаболітів оксиду азоту в аорті та плазмі крові щурів, а
також визначали зміни активності NO-синтаз і аргінази в судинній стінці.
В другій серії експерименту вивчали вплив ЛП атерогенних класів на зміни
продуктів ліпопероксидації та рівень стабільних метаболітів NO в судинній
стінці щурів різних вікових груп.
В третій серії досліджень вивчали вплив комбінації метаболічної речовини
(рибоксин) з L - аргініном на активність сNOS за умов дослідження in vitro.
Четверта серія експерименту була проведена in vivo, де вивчався вплив
комбінації рибоксину з L-аргініном на активність сNOS після попереднього
введення експериментальним тваринам інгібітора сNOS - NG- нітро - L-аргінін -
метилестер (L-NAME, “Sigma”, США), який вводили одноразово внутрішньоочеревино
в дозі 30мг / кг ваги тіла.
Спектрофотометричне визначення продуктів ліпідної пероксидації в судинній
стінці
Після легкого ефірного наркозу експериментальних тварин забивали шляхом
декапітації і через торако - абдомінальний розріз видаляли грудний та черевний
відділи аорти, очищували від сполучної тканини і заморожували в рідкому азоті
до моменту експерименту. Перед початком дослідів аорту за допомогою
гомогенізатору Поттера (тефлон / скло) гомогенізували в 50 мМ трис - HCl
буфері, рН 7,4 (співвідношення тканина / буфер 1:10). Первині продукти
пероксидації ліпідів екстрагували сумішю гептан / ізопропанол (1:1), яка
містила 1 ммоль ЭДТА [199]. Принцип методу полягає в тому, що в гептанову фазу
екстрагуються переважно нейтральні ліпіди, в ізопропанолову - ефірнозв`язані
продукти пероксидації фосфоліпідів, які є основними субстратами ПОЛ. За
допомогою спектрофотометричного вимірювання в гептановій і ізопропаноловій
фазах ліпідного екстракту визначали в ультрафіолетових спектрах на
спектрофотометрі СФ - 46 при довжині хвилі 214, 232, 278 нм відносно оптичного
контролю. Оптична густина при довжині хвилі 214 нм відповідає вмісту сполук з
ізольованими подвійними зв`язками (СІПЗ) в екстрагованих фосфоліпідах, при 232
нм – дієновим кон`югатам (ДК), при 278 нм – триєновим кон`югатам (ТК) та
кетодієнам (КД) [199]. Дієнові кон’югати розраховували, використовуючи
коефіцієнт молярної екстинції і виражали в нмоль / мг білка. Розрахунок
проводили за формулою:
С = Е х 109 х V
2,8 х 104 х 103 х мг білка
де С - вміст дієнових кон`югат, нмоль / мг білка;
Е - відповідна величина екстинкції;
V - об`єм гомогенату, мл;
2,8 х 104 х М?1 х см?1 - коефіцієнт молярної екстинкції.
Розрахунок вмісту інших продуктів ПОЛ проводили як співвідношення значення
відповідних Е до кількості білка в пробі. Крім того, за відношеннями Е232 /
Е214, Е278 / Е214 розраховували індекс окиснення за Волчегорським первинних
продуктів пероксидації ліпідів [200].
Кінцеві продукти пероксидації визначали у трихлороцтовому екстракті за реакцією
з тіобарбітуровою кислотою (ТБК - АП). Принцип методу визначення: за умов
високої температури в кислому середовищі частина продуктів ПОЛ, що відноситься
до класу гідропероксидів розкладається з утворенням малонового діальдегіду
(МДА); при взаємодії 1 молекули МДА з 2 молекулами ТБК утворюється хромогенний
триметиловий комплекс [201].
Вміст ТБК - АП розраховували, використовуючи формулу розрахунку:
С = Е х V х 109
1,56 х 105 х 103 х мг білка
де С - вміст кінцевих продуктів, нмоль / мг білка;
Е - відповідна величина екстинкції;
V - об`єм гомогенату, мл;
1,56 х 10 ?5 х М?1 х см?1 - коефіцієнт молярної екстинкції МДА;
106 - коефіцієнт перерахунку в нмоль.
Флюоресцируючі продукти (ФП) визначали в хлороформному екстракті гарячою
сумішшю хлороформ / метанол в об’ємному відношені 1:1 впродовж 1 хвилини.
Вимірювали спектри на флюориметрі "Hitachi": l збудження = 350 нм, l випускання
= 440 нм. Рівень виражали як відношення оптичної густини до маси білка в
пробі.
В хлороформному екстракті визначали вміст сумарних фосфоліпідів (ФЛ) після
мінералізації шляхом "мокрого" спалювання в суміші сірчаної та хлорної кислот
(1:1) і виражали в мкмоль / мг білка [202]. Білок визначали за модифікованим
методом Лоурі [203].
2.3. Визначення жирнокислотного с