РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали дослідження
В роботі були використані наступні плазмідні вектори, сконструйовані для
експресії в клітинах бактерій і ссавців: pGEX-2T/Ruk-SH3A, pGEX-2T/Ruk-SH3B,
pGEX-2T/Ruk-SH3C (вказані вектори були люб’язно надані проф. І. Гутом,
Лондонський університет, UCL, Велика Британія); pGEX-4T/CIN85-3SH3 (ця плазміда
була люб’язно надана Др. І. Дікісом, Інститут біохімії, Франкфурт, Німеччина);
pGEX-4T/Ruks, pRc/CMV2/Rukl, pRc/CMV2/Rukm, pRc/CMV2/Rukh, pCMV5/Rukl-Flag-tag,
pCMV5/Rukm-Flag-tag, pCMV5/Rukh-Flag-tag, pCMV5/?SH3А-Ruk-Flag-tag (вказані
вектори були люб’язно надані проф. В. Бучманом, Кардіфський університет, Велика
Британія); а також pcDNA 3.1-myc-tag-CD2AP (експресувальний вектор був люб’язно
наданий Др. A. Шао (Вашингтонський університет, Сант-Льюіс, США)).
32P-мічений зонд клону ЗЕ7 кДНК гену ruk був люб’язно наданий проф. В.
Бучманом, Кардіфський університет, Велика Британія.
В роботі також були використані анти-мишачі та анти-кролячі IgG, кон’юговані з
пероксидазою хрону (“Promega”, США), анти-FLAG, анти-myc, анти-в-актинові
антитіла (“Sigma”, США) та поліклональні анти-CD2AP антитіла (“Santa Cruz
Biotech”, США).
2.2. Об’єкти досліджень
Об’єктами досліджень були пухлини людини урогенітального походження, які
включали 20 зразків пухлин світлоклітинної карциноми нирки людини з
відповідними контрольними зразками (морфологічно незмінена тканина, ізольована
з того самого прооперованого органу при радикальній нефректомії) та 26 зразків
пухлин передміхурової залози людини (17 зразків – доброякісна гіперплазія та 9
зразків – аденокарцинома), які були надані для дослідження д.м.н. Шуляком О.В.
в рамках співпраці з кафедрою урології Львівського національного медичного
університету ім. Д. Галицького, а також 13 зразків пухлин гліального походження
людини, які були надані в рамках співпраці з обласним нейрохірургічним
відділенням Львівської обласної лікарні швидкої допомоги нейрохірургом Федорком
О.І. Діагнози та клінічні показники верифікували гістологічно в
патоморфологічних лабораторіях зазначених установ. Класифікацію пухлин
проводили згідно класифікації ВООЗ. Пацієнти були проінформовані та дали згоду
на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях.
Після хірургічного видалення зразки пухлинних та нормальних тканин промивали
охолодженим ЗФР (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na2HPO4, 1,7 мМ KH2PO4, pH
7,3) і моментально заморожували в рідкому азоті, після чого зберігали при -70
0С.
2.3. Методи досліджень
2.3.1. Методи культивування клітин
В експериментах було використано клітини таких ліній: NIH3T3 (фібробласти
миші), Cos1 (клітини нирки африканської зеленої мавпи), HEK293 (клітини
ембріональної нирки людини), HeLa S3 (клітини аденокарциноми шийки матки
людини), MDCK (епітеліальні клітини нирки Мадін-Дарбі собаки), С6 (клітини
гліоми щура), А549 (клітини аденокарциноми легень людини), L1210 (клітини
лейкемії миші), Ramos (клітини В-лімфоми людини), U937 (клітини гістоцитарної
лімфоми людини) та SрI (клітини мишачої мієломи). Клітини постійних ліній
вирощували в середовищах DMEM (“Sigma”, США) та RPMI (“Sigma”, США) за
присутності 10% ембріональної сироватки теляти (“GibcoBRL”, США), 2 мМ
L-глутаміну, 50 МО/мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину (“GibcoBRL”, США) в
зволоженій атмосфері з 5% СО2 при 37оС. Пасажування клітин проводили в
співвідношенні 1:3 – 1:5 кожні 2-3 доби при досягненні ними 70-80%
субконфлюенту для моношарових клітин та 1 млн/мл для суспензійних клітин.
Інтенсивність росту клітинної культури оцінювали, підраховуючи кількість клітин
в камері Горяєва. Кількість мертвих клітин визначали після їх фарбування
вітальним барвником трипановим синім (кінцева концентрація 0,1%).
Трансформовані бактерії E.coli штаму XL-1 Blue (“Stratagene”, США) вирощували в
середовищі Luria – Bertani (LB) з ампіциліном (0,05 мг/мл), а бактерії штаму
BL-21 (“Stratagene”, США) з екстраплазмідою резистентності до хлорамфеніколу –
в середовищі LB з додаванням хлорамфеніколу та ампіциліну (0,02 і 0,05 мг/мл,
відповідно) на шейкері при 37 0С.
2.3.2. Тимчасова трансфекція клітин лінії HEK293 Ca2+-фосфатним методом [211]
За 2-3 год до трансфекції клітини HEK293 розсівали на чашки Петрі діаметром 10
cм до 30-50%-ного конфлюенту. До прикріплених клітин обережно додавали по
краплях 1 мл свіжоприготовленої суміші такого складу: 61 мкл 2 М CaCl2, 0,5 мл
2-кратного HBS (137 мМ NaCl, 0,75 мМ Na2HPO4, 27 мМ Гепес, рH 7,0, 7-10 мкг
плазмідної ДНК доводились стерильною водою до об’єму 1 мл). Клітини
культивували протягом 12-16 год, змінювали середовище DMEM (“Sigma”, США) на
свіже з 10%-ною ембріональною сироваткою теляти і проводили культивування
протягом наступних 24-48 год, після чого клітини промивали холодним ЗФР (137 мМ
NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na2HPO4, 1,7 мМ KH2PO4, pH 7,3) і лізували.
2.3.3. Отримання клітинних лізатів [132]
Клітини двічі промивали охолодженим ЗФР і лізували на льодовій бані в буфері,
що містив 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мM NaCl, 1%-ний Тритон X-100, 5 мM EDTA,
50 мM NaF, 1 мМ Na3VO4, 5 мМ бензамідин, 25 мкг/мл апротиніну (“Sigma”),10
мкг/мл лейпептину (“Sigma”), 1 мкг/мл пепстатину (“Fluka”), 1 мМ PMSF (“Fluka”)
протягом 20 хв. Детергент-нерозчинну фракцію осаджували центрифугуванням при
12000 об/хв протягом 15 хв, а відібраний супернатант зберігали при -75 0С.
Концентрацію білка в супернатантах визначали за методом Петерсона [155].
2.3.4. Отримання тканинних екстрактів
Зразки пухлин розтирали в ступці з рідким азотом. Білки екстрагували у
співвідношенні 1:10 (вага:об’єм)
- Київ+380960830922