РОЗДІЛ 2
ХАРАКТЕРИСТИКА ОБ’ЄКТІВ І МЕТОДІВ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика об`єктів досліджень та методів ідентифікації штамів
мікроорганізмів
В роботі використано штами P. aeruginosa виділені на протязі 2002 – 2005 рр.
від хворих на ГЗЗ (149) та від сільськогосподарських тварин (29) та з продуктів
переробки твариництва (4), та одержані з філіалу музею мікроорганізмів ІМІ ім.
І.І. Мечникова АМН України (11) і еталонні штами „ІГН”, АТСС № 9027, АТСС №
27853. В якості штамів порівняння для частини експериментів використано
авторську колекцію О.В. Покас – штами Pseudomonas spp., виділені у 2001 – 2004
рр. від хворих з гнійно-запальними процесами в міській лікарні № 7 м. Києва
(авторські номери ІЕІХ №№ 1648, 2325, 2327). Всього вивчено 276 ізолятів
синьогнійної палички. В якості еталоних штамів на різних етапах досліджень було
використано: P. aeruginosa, P. fluorescens, E. coli, B.cepacia, та ін.
Загалом дослідженно: гнійний вміст інфікованих ран, кров, ексудат, змиви з
інвентарю, продукти переробки твариницьтва.
Забір матеріалу, виділення культур, їх ідентифікація, вивчення біологічних
характеристик мікроорганізмів проводили за допомогою загальновизнаних методик
відповідно до Наказу МОЗ СРСР і методичних рекомендацій [71]. Для кількісного
визначення обсіменіння ран посіви на щільні живильні середовища проводили за
методом Голда. При обстеженні клінічних хворих забір матеріалу здійснювали
стерильним тампоном з-під опікового струпа, післяопераційних
ексудативно-гнійних ран, трахеї, крові, сечі, фекалій, носоглотки медичного
персоналу, змивів з інвентаря. Після чого здійснювали посів на м’ясопептонний,
цукровий бульйон, кров'яний агар, середовища Ендо, Чистовича, Сабуро,
Плоськирєва та інші. Посіви інкубували в термостаті при 37°С на протязі 24
годин, а при відсутності росту – до 3 діб. Результати бактеріологічного аналізу
вважалися позитивними при виявленні в патологічному матеріалі більше 105 КОЕ/г
або КОЕ/мл. Виділення чистих культур здійснювали загально прийнятими методами.
Після отримання чистої культури збудника її ідентифікували по морфологічних,
тинкторіальним, біохімічних властивостях, що дозволило за визначником бактерій
Берджі визначити їх видову належність. Остаточну ідентифікацію виділених штамів
мікроорганізмів проводили за допомогою тест–систем NEFERMtest 24 (виробництва
PLIVA – Lachema a.s., Чехія) та api 20 Ne Ferm (BioMerieux, Франція).
Вивчення атипових за біохімічними характеристиками ізолятів Pseudomonas
проводилось за допомогою вивчення жирнокислотних спектрів. Для визначення
складу жирних кислот культури моноклони досліджуваних штамів висівали за
допомогою бактеріологічної петлі на скошений м`ясо-пептонний агар або на
агаризоване середовище № 8 (бульйон для вирощування Pseudomomas та
Staphylococcus з додаванням 1,5% агару). Культури вирощували 24 год. при 37°С,
біомасу змивали 5 мл фізіологічного розчину, осаджували за допомогою
центрифугування при 6000 об/хв., осад клітин промивали аналогічною кількістю
фізрозчину 2 рази, оскільки досліджувані штами характеризувалися інтенсивним
слизоутворенням в процесі інкубації. Визначення складу жирних кислот клітин
бактерій здійснювали за допомогою газо-рідинної хроматографії [23].
Гідроліз ліпідів та метилювання жирних кислот проводили з використанням вологої
бактеріальної маси [23]. До бактеріальної маси (кількістю біля 20 млрд.клітин),
двічі відмитої фізіологічним розчином від культурального середовища, добавляють
10 мл 1,5% розчину сірчаної кислоти у метанолі. Пробірку заповнюють цією
сумішшю, герметично загвинчують та витримують у водяній бані при 80ОС на
протязі 1 год. Після охолодження додають 2 – 3 мл дистильованої води і
проводять екстракцію метилових ефірів жирних кислот сумішшю діетилового ефіру і
гексану (1 : 1 за об`ємом) – двічі. Розчинник випаровують у струмені азоту, до
залишку добавляють 30 – 40 мкл зазначеної ефірно-гексанової суміші. 4 – 5 мкл
одержаного розчину вводять у газовий хроматограф. Метилові ефіри жирних кислот
аналізують на газовому хроматографі "Цвет – 110" з використанням
полуменево-іонізаційного детектора та скляної колонки довжиною 3 м та
внутрішнім діаметром 3 мм, заповненої 3%-ним SE-30 на інертоні AW-DMCS 0,200 –
0,250 мм. Температуру колонки програмують від 120 до 240ОС зі швидкістю нагріву
3 ОС/ хв., температура випаровувача – 270ОС. Газ-носій – азот, витрати азоту і
водню 2 л/год., повітря – 20 л/год.
Жирні кислоти ідентифікували шляхом порівняння часу їх утримання з часом
утримання стандартів (виробництва фірми "Serva", Німеччина). Для ідентифікації
ненасичених жирних кислот використовували також гідрування [173], для
циклопропанових – бромування [173], для оксикислот – трифторацетилювання [255].
Площі піків на хроматограмах обчислювали триангулярним методом, помножуючи
висоту на ширину, взяту на половині висоти. Потім визначали процент кожного
піку від загальної площі всіх піків.
Одержані в процесі газохроматографії жирнокислотні профілі атипових за
біохімічними ознаками штамів порівнювали з типовими для представників
Pseudomonas, Burkholderia, Aeromonas, Chromobacterium [21]. Одержані відомості,
використовували для остаточної ідентифікації видової належності клінічних
штамів роду Pseudomonas за допомогою комп`ютерної програми, розробленої в
Інституті мікробіології і віпусології ім. Д.К.Заболотного НАН України [64].
Програма розроблена з урахуванням 198 культурально-морфологічних, біохімічних,
хемотаксономічних тестів.
2.2. Визначення чутливості до антибіотиків
У роботі були використані декілька груп антимікробних препаратів: сполуки, що
інгібують синтез білка:
- Київ+380960830922