Морфо-функціональні зміни тимусу при старінні та пінеалектомії

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об’єкт дослідження
Об'єктом дослідження слугували тимуси самців щурів Вістар 4-х вікових груп:
статевозрілі (2 міс), молоді (7 міс), дорослі (13 міс) і старі (26 міс). Кожна
група складалася з 5 тварин. Зміни тимусу при старінні досліджували на
світлооптичному й електронномікроскопічному рівнях. Ультрацито­хіміч­не
дослідження активності лужної фосфатази (ЛФ) й Са2+-АТФази в тимусі при
старінні проводили на 2-х, 7-ми й 26-місячних щурах тієї ж лінії. Кожна вікова
група складалася з 3-х тварин.
Вивчався тимус 2-х, 7-ми й 26-місячних щурів-самців Вістар після пінеалектомії.
Кожна група складалася з 5-ти тварин. Шматочки тимуса кожної тварини були
проаналізовані на світлооптичному й електронномікроскопічному рівнях, із
застосуванням ультрацитохімії й морфометрії. Контролем слугували
несправжньооперовані тварини тих же вікових груп (по 3 тварини у кожній
групі).
В усіх випадках встановлювали масу тимусу.
Усього в дослідженні було використано 73 щура (самця) Вістар. Тварини
утримувалися в стандартних умовах експериментально-біологічної клініки
Інституту геронтології АМН України.
2.2. Світлооптичне дослідження
Препарати для світлової мікроскопії готували по методу G. Saіnt-Marіes [131].
Шматочки тимусу фіксували в 70% етанолі (3 години при температурі +4єС),
знезводнювали у 96% етанолі (протягом ночі), холодному абсолют­но­му етанолі (2
год 30 хв) і холодному ксилолі (1 год 30 хв). Потім просочували їх у парафіні в
термостаті (3 год при 56єС), поміщали в парафін з додаванням бджолиного воску.
Зрізи товщиною 4-5 мкм виготовляли на мікротомі Microm (Zeiss, Germany)
забарвлювали гематоксилін-еозином, проводили ШИК-реакцію, вивчали у світловому
мікроскопі Axіolab (Zeіss, Germany).
2.3. Електронномікроскопічне дослідження
Препарати для електронної мікроскопії готували по методу S. Taіzan [132].
Шматочки тимусу фіксували у 2,5% розчині забуференого глютаральдегіду (2 год
при +4єС), промивали протягом ночі в промивному розчині, дофіксовували 1%
розчином тетроксиду осмію на промивному розчині (приготований за спеціальною
методикою фосфатний буфер), зневоднювали в спиртах висхідної концентрації й
ацетоні (50%, 70%, 96% - по 1год 30 хв, 100% - 30 хв; в ацетоні - 2 рази по 10
хв). Просочували в суміші смол з ацетоном (1:3 – 1год 30 хв; 1:1 – 1год 30 хв;
3:1 - протягом ночі). Заливання в смоли, готування ультратонких зрізів на
ультратомі LKB ІІІ й контрастування проводили за загальноприйнятою методикою.
Зрізи досліджували в електронному мікроскопі ПЕМ-125К.
2.4. Морфометрія
Морфометрію виконували на світлооптичному та електронно­мікро­скопіч­ному
рівнях. На світлооптичному рівні визначали співвідношення площі лімфоїдної і
жирової тканини, ступінь васкуляризації тимусу та кількість тілець Гассаля.
Ступінь васкуляризації розраховували як кількість капілярів на тестову площу,
за яку приймали площу дольки тимусу. Кількість тілець Гассаля підраховували в
мозковій речовині усіх дольок тимусу.
На електронномікроскопічному рівні підраховували співвідношення клітинних
елементів тимусу, кількість тимоцитів, що перебувають на різних стадіях
апоптозу, вимірювали товщину базальної мембрани, площу перетину ендотеліоцитів,
площу перикапілярного простору та площу, зайняту колагеном. Вимірювання
проводили за допомогою відеосистеми й пакета програм для морфометрії
Promorph-Paradіse (НВК "Ева", Київ). Статистичний аналіз виконаний за допомогою
критеріїв Стьюдента та Вілкоксона-Манна-Уїтні. Достовірними вважалися зміни при
p<0,05.
Статистична обробка й побудова гістограм були проведені за допомогою пакета
програм "Mіcrosoft® Excel XP" (Mіcrosoft Corp., USA) на персональному
комп'ютері ІBM Pentіum ІV 2,4 GHz з операційною системою Mіcrosoft Wіndows XP.
2.5. Ультрацитохімічне визначення лужної фосфатази та Са2+-АТФази
Для ультрацитохімічного дослідження лужної фосфатази брали шматочки тимусу
циліндричної форми. Матеріал фіксували протягом 35 хвилин при 4єC у фіксаторі,
що містив 2 % параформальдегіду, 0,25 % глютаральдегіду, 4 % сахарози і 10 %
диметилсульф­оксиду на какодилатному буфері (0,05 М, рН 7,4). Після промивання
у 8 % розчині сахарози на тому ж буфері, шматочки подрібнювали.
Для ультрацитохімічного визначення ЛФ було використано свинцевий метод Гоморі,
модифікований Бухваловим [133]. Як субстрат використовували в-гліцерофосфат.
Інкубація шматочків тимусу проводилася протягом 35 хвилин при температурі
20 °C. У контрольних дослідах інкубацію було проведено в середовищі без
субстрату. Після інкубації шматочки тканини промивали в 8 % розчині сахарози і
поміщали на 30 хв у 1 % розчин OsO4 на 0,05М какодилатному буфері (pH 7,4),
зневоднювали у спиртах зростаючої концентрації та ацетоні, заливали в суміш
епона з аралдитом за загальноприйнятою методикою. Ультратонкі зрізи,
виготовлені на ультратомі LKB-III (Швеція), вивчали в електронному мікроскопі
ПЕМ-125К ("Selmi", Україна).
Для ультрацитохімічного визначення активності Са2+-АТФази використовувався
метод Mayahara (1967) [134]. Шматочки тканини занурювали в пробірку з
фіксатором на 30-60 хвилин при температурі 0-4°С. Фіксатор містив 4% розчин
формальдегіду, приготований з параформальдегіду на какодилатному буфері (рН
7,5) і 2,5% глютаральдегіді. Потім шматочки промивали на холоді три рази в 8%
розчині сахарози на 0,1М какодилатному буфері по 10, 20 і 30 хвилин, і поміщали
в інкубаційні середовища. Для визначення активності Са2+-АТФази використовували
середовище розроблене Маяхаре. У якості субстрату використовували АТФ. Шматочки
тканини інкубували протягом 30 хвилин при 37°С. Після проведення