РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Напівхронічні експерименти були проведені на білих щурах-самцях лінії Вістар вагою 280-300 г з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (міжнародна конвенція, Страсбург, 1986) в два етапи. На першому етапі проводили модифікацію клітинних мембран шляхом додавання до стандартного раціону віварію субстанцій ?-3 ПНЖК в хронічних дослідах. На другому етапі в гострому експерименті на ізольованому перфузованому серці та тваринах з іммобілізаційним стресом досліджували кардіопротекторні ефекти ?-3 ПНЖК. Тварин утримували протягом 4-х тижнів у звичайних умовах: звичайний світловий та температурний режим, повсякденний раціон.
Експериментальний протокол
Всі піддослідні тварини були розподілені на 9 груп по 10 тварин у кожній:
1. інтактні тварини, що слугували контролем, та утримувалися на стандартному раціоні віварію;
2. тварини, що утримувалися на стандартному раціоні віварію, ізольовані, перфузовані серця яких піддавали впливу ішемії-реперфузії;
3. тварини, яким додавали до стандартного раціону ?-3 ПНЖК тваринного походження (епадол - 0,1мл на 100г маси тіла щура) протягом 4-х тижнів;
4. тварини, яким додавали до стандартного раціону субстанцію ?-3 ПНЖК рослинного походження (0,1мл на 100г маси тіла щура) протягом 4-х тижнів;
5. тварини, що утримувалися на стандартному раціоні віварію, яких піддавали впливу гострого іммобілізаційного стресу;
6. тварини, яким додавали до стандартного раціону ?-3 ПНЖК тваринного походження (0,1мл на 100г маси тіла щура) протягом 4-х тижнів, серця яких піддавалися впливу ішемії-реперфузії;
7. тварини, яким додавали до стандартного раціону ?-3 ПНЖК тваринного походження (0,1мл на 100г маси тіла щура) протягом 4-х тижнів, та піддавалися впливу гострого іммобілізаційного стресу (6 год);
8. тварини, яким додавали до стандартного раціону субстанцію ?-3 ПНЖК рослинного походження (0,1мл на 100г маси тіла щура) протягом 4-х тижнів, серця яких піддавалися впливу ішемії-реперфузії;
9. яким додавали до стандартного раціону субстанцію ?-3 ПНЖК рослинного походження (0,1мл на 100г маси тіла щура) протягом 4-х тижнів, та піддавалися впливу гострого іммобілізаційного стресу ;
Ізольовані серця тварин 2, 6, 8 групи піддавали впливу 20-хвилинної тотальної ішемії з наступною 40-хвилинною реперфузією.
Тварини 5, 7, 9 групи піддавали впливу гострого іммобілізаційного стресу, який викликали фіксацією тварин на спині протягом 6 годин в стані нерухомості.
Модифікація мембран: тварини 3, 6, 7 групи отримували препарат "епадол", що містить 45% ?-3 ПНЖК тваринного походження (суміш ЕПК та ДКГ з риб'ячого жиру), виробництва Київського вітамінного заводу.
Тварини 4, 8, 9 групи отримували субстанцію ?-3 ПНЖК рослинного походження, яка містить ?-ЛК (63%), що отримували з рослинної сировини. Ця субстанція була розроблена спільно з співробітниками лабораторії хімічної ензімології Київського інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (при допомозі к.м.н. Харченко О.В.). Тварини отримували ?-3 ПНЖК у дозі 0,1 мг/100 г маси тіла протягом 4 тижнів, як додаток до стандартного раціону віварію Інституту фізіології ім. О.О.Богогмольця.
Визначення жирнокислотного складу клітинних мембран. Зміни жирнокислотного складу клітинних мембран визначали в ліпідному екстракті гомогенатів тканини міокарда та печінки, оцінюючи вміст ?-6 ПНЖК (АК та ЛК) та ?-3 ПНЖК (ЕПК, ДГК та ?-ЛК). Для екстракції ліпідів з тканини серця до 0,1-0,5 г тканин серця (або печінки) додавали 1,5 мл води та гомогенізували в гомогенізаторі Потера при кімнатній температурі протягом 2 хв. До гомогенату додавали 15 мл суміші хлороформ : метанол (1 : 2) та знову гомогенізували. Гомогенат центрифугували при 5000 об/хв протягом 30 хв при 4°С на центрифузі РС-6. Супернатант декантирували, а осад реекстрагували 19 мл суміші хлороформ : метанол : вода (1:2: 0,8) в гомогенізаторі Потера протягом 2 хв. Потім екстракт центрифугували (2500 об/хв, 30 хв, РС-6). Супернатанти об'єднували, додавали до них 10 мл хлороформу та 10 мл води. Водно-метанольну та хлороформну фазу розділяли центрифугуванням. Нижній хлороформний шар концентрували на роторному випаровувачі при 30-35°С. Слідові кількості води видаляли, додаючи бензол або сульфат натрію. Розчиняли залишок в 5 мл хлороформу, потім хлороформ випаровували. До залишку додавали 5 мл 0,7Н розчину НСІ / метанол та кип'ятили із зворотнім холодильником та хлор-кальцієвою трубкою для захисту від вологи протягом 1,5-2 год. До охолодженої суміші додавали 0,5 мл води та 5 мл суміші метанол : вода у співвідношенні 9:1. Метилові ефіри жирних кислот екстрагували тричі 6 мл гексану. Об'єднані гексанові екстракти висушували за допомогою сульфату натрію та упаровували. Метилові ефіри жирних кислот розчиняли в метанолі та аналізували, використовуючи у якості стандартів спеціально синтезовані метилові ефіри лінолевої, арахідонової, ?-ліноленової, ейкозапентаєнової та докозагексаєнової кислот. Кількісне та якісне визначення вмісту ефірів жирних кислот в сумішах проводили методом високоефективної рідинної хроматографії. Розділення метилових ефірів ПНЖК проводили на колонці LiChrosorb RР-18 (Merck), рухома фаза - метанол : вода - 9 : 1 (0,1 % Н3РО4, v/V), використовуючи рефрактометричний детектор. Піки високоефективної рідинної хроматографії були ідентифіковані за часом утримування на колонці порівнюючи з спеціально синтезованими метиловими ефірами лінолевої, арахідонової, ?-ліноленової, ейкозапентаєнової та докозагексаєнової кислот [23]. Вміст цих кислот виражали у відсотковому співвідношенні до загального вмісту жирних кислот прийнятого за 100 %. Матеріал для дослідження забирали в контролі, після 4 тижнів застосування ?-3 ПНЖК, після відтворення ішемії-реперфузії ізольованого серця щура, після 4 тижнів застосування ?-3 ПНЖК та відтворення ішемії-реперфузії ізольованого серця щура.
Дослідження функцій ізольованого серця за методом Лангендорфа. Тварин анестезували уретаном (1,9 г/кг маси) [58], за 10 хв до ви
- Київ+380960830922