РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методики дослідження спектральних властивостей барвників та їхніх комплексів з біополімерами
Для вивчення спектрально-люмінесцентних властивостей синтезованих барвників та їх комплексів з нуклеїновими кислотами та білками були використана спектроскопія електронного поглинання та флуоресцентна спектроскопія за ОФЗ та ДФЗ. Всі спектроскопічні вимірювання виконувались при кімнатній температурі.
Електронні спектри поглинання записували на приладі "Specord M-40" (Німеччина), який має дві дифракційні гратки по 1302 штрих/мм. Спектральний діапазон приладу становив 185-900 нм. Похибка визначення довжини хвилі при 185 нм була 0.03 нм, а при 900 нм - 0.1 нм. Точність вимірювання оптичної густини дорівнювала 0.005. Роздільна здатність приладу становила 0.06 нм при 250 нм та 0.12 нм при 500 нм. Виміри проводили в кварцових кюветах (10х10 мм).
Для реєстрації спектрів флуоресценції та збудження флуоресценції використовували флуоресцентний спектрофотометр "Cary Eclipse" (Varian, Австралія). Усі виміри проводились у кварцовій кюветі (10х10 мм). Для збудження флуоресценції використовували випромінювання ксенонової лампи (150 Вт). .Довжину хвилі збудження флуоресценції вважали рівною довжині хвилі максимуму смуги збудження флуоресценції барвника у відповідному розчині. Похибка визначення довжини хвилі флуоресценції та збудження флуоресценції становила 1 нм.
Реєстрація спектрів флуоресценції за ДФЗ на довжині хвилі 1064нм проводилась з використанням YAG:Nd3+ лазера, який генерував імпульси тривалістю 15 нс з частотою 6 Гц (герц). Випромінювання флуоресценції розчину реєструвалось під кутом 90 градусів до напрямку освітлення та збираючею лінзою проектувалось на вхідну щілину монохроматора (монохроматор скомпонований за схемою Черні-Тернера з граткою 600шт./мм, ширина щілин 1мм, розділення по довжинах хвиль - 1нм). Після спектрального розділення випромінення потрапляє на фотоелектропомножувач.
На цій же установці знімали спектри флуоресценції за ОФЗ (для коректного порівняння із спектрами флуоресценції за ДФЗ), для чого лазерне випромінювання спочатку спрямовували на генератор другої гармоніки, який продукував випромінення з довжиною хвилі 532нм. Похибка визначення довжини хвилі флуоресценції була 1 нм.
Візуалізація клітин здійснювали за допомогою оптичної системи "Till Photonics" (TILL Photonics, Німеччина) за використання CCD камери Imago. Зображення отримували за допомогою фотосиcтеми Olympus IX 70.
1H ЯМР спектри були записані в ДМСО-d6 на приладі "Varian" (300 MHz), використовуючи ТМС як внутрішній стандарт. Описуючи 1Н ЯМР спектри використовувались наступні скорочення: наведені положення (м.ч.), інтенсивність сигналу, його форма (с - синглет, уш с - уширений синглет, д - дублет, уш д - уширений дублет, д д - дублет дублетів, т - триплет, уш т - уширений триплет, кв - квартет, квінт - квінтет, м - мультиплет), константа спін-спінової взаємодії (Гц).
Мас-спектри отримані на ВРХ "Agilent 1100 Series".
2.1.1. Приготування стокових розчинів НК, БСA та барвників. Стокові розчини барвників (2.10-3 M) готували, розчиняючи наважки барвників у ДМФА. Тотальна ДНК з лосося, сумарна дріжджова РНК та БСA були одержано з "Sigma" (США). Стокові розчини нуклеїнових кислот та БСА готували розчиняючи наважки біополімеру у 0.05 M Tris (тріс-оксиметил-аміно-метан) - HCl буфері (pH 8.0). Концентрація НК та БСА в розчині становила 6.10-3 М пар основ (п.о.) для ДНК, 1.2.10-2 М о. для РНК та 0.2 мг/мл для БСА.
2.1.2. Приготування робочих розчинів. Робочі розчини барвників готували, розводячи стокові розчини барвників у буфері чи метанолі. Робочі розчини комплексів барвник-ДНК (-РНК) були приготовлені, додаючи аліквоти стокових розчинів барвників та нуклеїнових кислот до буфера. Робочі розчини барвника з БСА були приготовлені, додаючи стоковий розчин барвника в стоковий розчин білку. Концентрації барвника, ДНК, РНК та БСА в робочих розчинах становили відповідно 5?10-6 M, 6?10-5 M п.о., 1.2?10-4 M о. та 0.2 мг/мл.
У двофотонних дослідженнях концентрація стирилціанінових барвників, ДНК та РНК в розчинах становила відповідно 1.5?10-5 M, 1.8?10-4 M п.о. та 3.6?10-4 M о. Концентрація барвника Rhodamine 6G (одержано з "Sigma" (США)), який використовувався для порівняння, становила 5?10-6 M.
2.1.3. Визначення перерізу двофотонного поглинання. Вимірюючи спектри флуоресценції стирилціанінових барвників та Rhodamine 6G, переріз двофотонного поглинання якого відомий [123, 124], за одно- та двофотонного збудження та електронні спектри й підставляючи отримані дані у формулу (2.1) [125, 126] ми отримували перерізи двофотонного поглинання () синтезованих барвників.
(2.1)
де - інтегральна інтенсивність флуоресценції Rhodamine 6G за ОФЗ,
- інтегральна інтенсивність флуоресценції барвника за ДФЗ,
- переріз однофотонного поглинання барвника на довжині хвилі 532 нм,
- інтегральна інтенсивність флуоресценції Rhodamine 6G за ДФЗ,
- інтегральна інтенсивність флуоресценції барвника за ОФЗ,
- переріз однофотонного поглинання Rhodamine 6G на довжині хвилі 532 нм.
Переріз однофотонного поглинання розраховували за формулою: =D/nl, де D- оптична густина на довжині хвилі 532 нм, n - кількість хромофорів в 1 см3, l - 1 см.
2.1.4. Визначення констант зв'язування барвників з ДНК. Константа зв'язування барвника з ДНК є характеристикою міцності утвореного ним комплексу. Нехай взаємодія барвника з ДНК відбувається лише за одним механізмом, тоді Кзв визначають за формулою:
(2.2)
де Cзв - концентрація зв'язаних з ДНК молекул барвника,
Cв - концентрація вільних молекул барвника,
Cвс - концентрація пар основ ДНК.
З даних титрування барвника розчином ДНК визначали Кзв. Інтенсивність флуоресценції ДНК-комплексу барвника значно переважає інтенсивність його власного випромінювання, тож інтенсивність флуоресценції барвника в присутності ДНК (