РАЗДЕЛ 2
2.1. Материалы
Фенол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)o-Хлорфенол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)м-Хлорфенол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)п-Хлорфенол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)2,4,6-Трихлорфенол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Пирокатехин, "ч.д.а." "Reanal" (Венгрия)Резорцин, фарм."Химреактив" (Россия)Гидрохинон, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Пирогаллол, "ч.д.а." "Химреактив" (Россия)о-Крезол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)м-Крезол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)п-Крезол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)п-Нитрофенол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Салициловая кислота, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)?-Нафтол, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Пероксидаза хрена"Sigma" (США)Каррагинан из Phyllophora nervoza
(М.м. 120 кДа), ?-каррагинан и его модифицированные формыГП Одесского центра ЮгНИРОГидратцеллюлозная мембрана "Диацелл"ОАО "Гемопласт",
г. Белгород-ДнестровскийПоли-N-винилкапролактам (М.м. 1,5·106 Да)
Поли-N-винилпирролидон (М.м. 2 ·106 Да)Академия тонкой химической технологии, г. МоскваПластины "Silufol"(Чехия)ПЭГ-6000"Merk", ФРГСиликагель"Reanal" (Венгрия)Кальция хлорид, "ч.д.а.""Химреактив", РоссияМарганца хлорид, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)БСА"Sigma" (США)Аммония сульфат, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Аммония хлорид, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Этиловый спирт, "ч.д.а.""Тор" (Украина)Метиловый спирт, "ч.д.а.""Тор" (Украина)Фенантролин моногидрат, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Железа (III) хлорид гексагидрат, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Глицин, "ч.д.а.""Reanal" (Венгрия)Натрия карбонат, "ч.д.а." "Химреактив" (Россия)Пероксид водорода, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Натрия гидроксид, "х.ч.""Химреактив" (Россия)Аммония гидроксид, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)4-Аминоантипирин, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Калия феррицианид, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Калий-натрий тартрат, "х.ч." "Химреактив" (Россия)Меди сульфат пентагидрат, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Кумасси R-250, "ч.д.а.""Serva" (ФРГ)Кумасси G-250, "ч.д.а.""Serva" (ФРГ)Калия хлорид, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Борная кислота, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Натрия хлорид, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Соляная кислота, "ч.д.а.""Тор" (Украина)Уксусная кислота, "ч.д.а.""Тор" (Украина)Натрия дигидрофосфат, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Динатрия гидрофосфат, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Калия дигидрофосфат, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Лимонная кислота, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Периодат натрия, "ч.д.а.""Reanal" (Венгрия)Боргидрид натрия, "ч.д.а.""Reanal" (Венгрия)Гидроксиламингидрохлорид, "ч.д.а.""Reanal" (Венгрия)Бромфеноловый синий, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Натрия сульфит, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)2,4,6-Тринитробензолсульфокислота, "ч.д.а." "Химреактив" (Россия)Натрия тетраборат, "ч.д.а." "Химреактив" (Россия)Натрия ацетат, "ч.д.а.""Химреактив" (Россия)Хлороформ, "ч.д.а.""Тор" (Украина)Гексан, "ч.д.а.""Тор" (Украина)Ацетон, "ч.д.а.""Тор" (Украина)ДМСО, "ч.д.а.""Тор" (Украина)ДМФА, "ч.д.а.""Тор" (Украина)Натрия додецилсульфат, "ч.д.а.""Serva" (ФРГ)2-меркаптоэтанол, "ч.д.а.""Serva" (ФРГ)Изопропанол, "ч.д.а.""Тор" (Украина)Формальдегид, "ч.д.а.""Тор" (Украина)
Приборы:
Термостат ТПС, ТУ 64-1-1374-80
Термостат ІТЖ, ТУ 64-1-3229-80
Мас-спектрометр МХ-1321
Спектрометр Specord 75 IR
рН-метр рН-673 М
Спектрофотометр СФ-46 ЛОМО № 301104
Фотоколориметр КФК-2
Объектный микрометр ОМО № 620494
Камера Горяева
Магнитная мешалка ММ - 5
Весы лабораторные АДВ-200 М
2.2. Методы эксперимента
2.2.1. Выделение пероксидазы из корней хрена
Метод I [178]: измельчают 200 г очищенных корней хрена, полученный сок пропускают через несколько слоев марли, добавляя 0,1 объема раствора К2НРО4, (0,1 М), после чего центрифугируют при 6000 об./мин в течение 15 мин. К полученному супернатанту при 4 ?С прибавляют насыщенный водный раствор сульфата аммония до степени насыщения 35 %, выдерживают 60 мин, центрифугируют 15 мин при 6000 об./мин, затем добавляют к супернатанту указанный раствор до степени насыщения 90 % и оставляют для осаждения на сутки при 0-4 ?С. Выпавший осадок препарата отделяют центрифугированием при
6000 об./мин в течение 15 мин, суспендируют в минимальном объеме трис-НCl буферного раствора (0,05 М, рН 7,0) и проводят диализ против этого же буферного раствора на протяжении 12 ч. Содержимое диализного мешка центрифугируют
15 мин при 6000 об./мин, супернатант используют в качестве источника препарата пероксидазы.
Метод II [179]: 200 г измельченных корней хрена на протяжении 3-х дней мацерируют в 100 см3 воды при температуре 0-4 ?С, затем отжимают. Полученный экстракт фильтруют и осаждают тремя объемами 96 %-ного этилового спирта. Осадок отфильтровывают и затем высушивают над хлористым кальцием.
Метод III [180]: 200 г измельченных корней хрена 3 дня мацерируют в 100 см3 воды при температуре 0-4 ?С, затем отжимают. Полученный экстракт сгущают в вакууме при 20-22 ?С в течение 6 ч и осаждают из раствора тремя объемами 96 %-ного этилового спирта. Полученный осадок высушивают над хлористым кальцием.
Метод IV [181]: 200 г измельченных корней хрена 3 дня мацерируют в 200 см3 воды при температуре 0-4 ?С, затем отжимают. Полученный экстракт пропускают через слой силикагеля. К фильтрату добавляют 200 г сульфата аммония, выпавший осадок отделяют фильтрованием через слой силикагеля (полученный фильтрат дальше не использовался). Осадок экстрагируют в 25 см3 дистиллированной воды. Затем к полученной смеси добавляют 5,0 г сульфата аммония и после растворения соли смесь выдерживают при 0-4 ?С в течение 4 ч, осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. К фильтрату добавляют 15 см3 раствора пероксидазы из предыдущего опыта и 10 г сульфата аммония, смесь при 4 ?С выдерживают в течение суток, затем осадок отделяют через слой силикагеля. Полученный при этом фильтрат отбрасывают, осадок растворяют в 5 см3 воды и пропускают через слой силикагеля.
- Київ+380960830922