РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Дослідження проведені на вагітних самицях щурів популяції Вістар та їх нащадках різного віку. Всього в експериментах було використано 1192 щура різних вікових груп.
Щурів утримували при кімнатній температурі та природному освітленні. Всі тварини знаходилися на рекомендованому для них раціоні віварію. Маніпуляції з тваринами (отримання вагінальних мазків, зважування, введення препаратів, додаткове стресування, знеживлення) здійснювали у першій половині дня (9-11 год.), до приймання їжі. Враховуючи наявність циркадних і сезонних ритмів рівня статевих гормонів та гормоні ГГНС [250, 251] та вмісту і обміну нейромедіаторів [252], експерименти проводили переважно у зимово-весняний період (лютий - травень). Кожна піддослідна група тварин вивчалася одночасно з відповідною контрольною групою.
Для спаровування відбирали статевозрілих самиць масою 180-220 г з нормальним естральним циклом, який встановлювали методом цитологічної оцінки вагінальних мазків [253]. Самиць у стадії проеструсу підсаджували до сексуально активних інтактних самців (одна самиця - один самець). За першу добу вагітності вважали день появи у вагінальному мазку сперматозоїдів.
Материнський соціальний стрес моделювали шляхом щоденної зміни угрупування невагітних статевозрілих самиць, в якому самиця піддослідної групи перебувала протягом 6-годинного світлового періоду з другої по восьму добу вагітності [25]. Після стресування кожну з цих самиць залишали в окремій клітці, де вона і знаходилася весь період спостережень. Контрольні вагітні самиці утримувалися у стандартних умовах віварію, кожна в окремій клітці, протягом усієї вагітності. Відомо, що у тварин, яких поміщають до збалансованої колонії спостерігається весь спектр притаманних стрес-реакції змін, а саме: підвищення маси НЗ, рівня А та НА, моноаміноксидази, тирозингідроксилази, фенілетаноламін-N-метилтрансферази, вивільнення КС, гіпертензивні реакції [254, 255]. В той же час, використана модель практично виключає додатковий вплив на піддослідну тварину з боку дослідника, що обумовлює доцільність її використання у вагітних тварин.
Частину самиць декапітували на 20-ту добу вагітності, інших - залишали до природних пологів. У декапітованих тварин підраховували кількість жовтих тіл в яєчниках, число місць імплантації та живих плодів у матці, на підставі чого визначали до- та післяімплантаційну загибель ембріонів і відсоток загальної ембріональної смертності [256]. Рівень доімплантаційної загибелі зигот встановлювали по різниці між кількістю жовтих тіл в яєчниках та кількістю міст імплантації у матці, а рівень післяімплантаційної загибелі - по сумі резорбцій та загиблих ембріонів у матці. Плоди та плаценти зважували, вимірювали краніо-каудальний розмір.
У самиць визначали індекс вагітності (доля вагітних самиць у групі), спостерігали за перебігом вагітності та пологів, підраховували кількість щурят у приплоді та співвідношення самців і самиць у приплоді, зважували новонароджених. У 30-денному віці тварин розподіляли за статевою ознакою і розміщували по 4-5 особин у стандартній клітці.
Для оцінки фізичного розвитку нащадків тварин зважували кожні 10 діб (до 60 доби життя) та перед знеживленням. Реєстрували такі показники, як час відлипання вушок, поява волосяного покриву, прорізання зубів, відкриття очей [253].
Статевий розвиток щурів оцінювали шляхом вимірювання ано-генітальної відстані у першу добу життя, часом опущення яєчок у мошонку та відкриттям піхви [101, 257].
Відомо, що в 40-45-денному віці щури вступають у стадію пубертату, що характеризується перебудовою нейроендокринної системи, а 90-денні тварини мають сформовану та активно функціонуючу систему репродукції [258], тому для оцінки стану органів РС та визначення рівня статевих гормонів використовували тварин цих вікових груп.
Тварин знеживлювали швидкою декапітацією згідно з умовами експериментів. Після декапітації головний мозок виймали з черепної коробки і вилучали на холоду гіпоталамус.
Для морфологічних досліджень вилучали надниркові та статеві залози, які зважували, а потім фіксували у 10 % розчині формаліну, заливали у целоїдин-парафін. Для виготовлення гістологічних зрізів використовували санний мікротом. Зрізи фарбували гематоксилин-еозином по Майеру [259]. Оцінку гістостуктури проводили на мікроскопі "Jenaval" (Німеччина).
У тварин брали зразки крові, у разі потреби отримували плазму.
Визначення концентрації статевих гормонів (Т, Е2) в крові було проведено методом радіоімунологічного аналізу, використовуючи стандартні комерційні набори виробництва Інституту біоорганічної хімії АН Білорусії (м. Мінськ). Концентрацію тестостерону та естрадіолу виражали у нмоль/л.
У статевозрілих самців вміст НА, ДА та СТ визначали у цілому гіпоталамусі спектрофлуориметричним методом [260].
У тварин статевозрілого віку (90 днів) було вивчено низку інтегральних фізіологічних показників, які характеризують стан репродуктивної функції щурів-самців.
Для оцінки чоловічої статевої поведінки нащадків спостерігали за статевими контактами самців з рецептивними оваріектомованими самицями,
які були піддані фармакологічній обробці жіночими статевими гормонами за схемою, яка полягала у послідовному уведенні естрадіолу бензоату у дозі 10 мкг на тварину за 48 годин та прогестерону у дозі 500 мкг на тварину за 4-5 годин перед тестом [261, 262].
Беручи до уваги циркадний ритм статевої активності у щурів, дослідження проводили увечері, при червоному світлі, в спеціальній тест-клітці [74, 263]. Тривалість тесту складала 15 хвилин.
Для формування у тварин стереотипних реакцій та отримання ними сексуального досвіду було проведено три поведінкових тести з рецептивними самицями. Рівень статевої активності досліджуваних самців оцінювали за результатами четвертого тесту. Реєстрували такі показники: кількість та латентний період садок, інтромісій та еякуляцій, постеякуляторний рефрактерний період (час між еякуляцією та початком наступної серії прояву статево
- Київ+380960830922