РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт дослідження і організація експериментів
Дослідження були проведені на 280 нелінійних щурах-самцях, які на початок експерименту мали вік два місяці та масу 125 - 135 г. Перед введенням експеримент тварин витримували в карантині за всіма правилами зоогігієни. Протягом експерименту тварин утримували в стандартних клітках у світлому приміщенні з постійною температурою 20 - 25 оС й вологістю повітря 40 - 45 %. Клітки регулярно прибирали і щотижня дезинфекували крутим окропом та 5 - 10 % розчином їдкого лугу [249].
Раціон тварин складався з розрахунку добової потреби при вільному доступі до води. Для щурів у середньому потреба в кормі складає 30 - 32 г, з яких 25 г змішаного корму та 5 - 7 г овочів. До змішаного корму входив комбікорм (пшениця, овес, ячмінь, просо), який постачає організм білками, вуглеводами, мінералами і мікроелементами в раціональних дозах. З овочів давали коренеплоди. Крім того, в раціон додавали соковиті корми [249].
Дослідження динаміки вмісту кальцію в головному мозку та печінці були проведені на 4-х групах щурів.
Тварини групи 1 (n=64) були контрольними.
У тварин групи 2 (n=70) викликали екзогенну ГХЕ за класичною методикою шляхом щоденного додавання до їжі ХС (0,5 г/кг маси тіла) і солей жовчних кислот (0,1 г/кг маси тіла). Солі жовчних кислот є сильними стимуляторами секреції жовчі, яка сприяє емульгації жирів та їх всмоктуванню [185, 247].
У тварин групи 3 (n=74) моделювали ендогенну ГХЕ шляхом постійного обмеження життєвого простору до 100 см2 на одну тварину. Це досягалося тим, що в стандартну клітку, де повинно утримуватись 2-3 тварини, розміщували 15-18 щурів. Для тварин цього виду така зооконфліктна ситуація служить сильним стресовим фактором. [250]. Відомо також, що вплив стресових агентів виявляється набагато сильніше під дією кондиціонуючих факторів. Одним із таких факторів є кухонна сіль [251]. Тому тваринам даної групи до звичайного харчового раціону додавали NaCl з розрахунку 2 г/кг маси тіла. Зазначений метод моделювання ендогенної ГХЕ у щурів був розроблений на кафедрі фізіології людини і тварин Дніпропетровського національного університету [252, 253].
У тварин групи 4 (n=72) поряд з моделюванням ендогенної ГХЕ вищезазначеним способом для виявлення можливих механізмів зміни рівня кальцію в тканинах головного мозку та печінки застосовували антагоніст кальцію ніфедипін у дозі 2 мг/кг маси тіла щодоби. Ніфедипін належить до дигідропіридинових блокаторів потенціалзалежних кальцієвих каналів L-типу. Його зв'язування з дигідропіридиновим рецептором змінює функцію каналу, порушуючи регулярність переходу каналу у відкритий стан після деполяризації. В результаті скорочення часу відкриття каналу значно знижується трансмембранний кальцієвий струм. Даний препарат знижує вхід Са2+ і через рецепторзалежні канали, але у великих концентраціях. При прийомі всередину він практично повністю абсорбується у ШКТ. Біодоступність складає 40 ? 60%. Оскільки при прийомі препарату з їжею максимальна концентрація його в крові виявляється через 60 ? 120 хвилин, а період напіввиведення нирками складає 2 ? 4 години (кумуляція відсутня), то визначення вмісту кальцію у головному мозку та печінці і ХС у сироватці крові тварин групи 4 проводили через 1 годину після прийому ніфедипіну [96, 254, 255]. Певна кількість ніфедипіну проходить через гематоенцефалічний бар'єр (за даними літератури 15-20%) [256, 257].
Експеримент тривав 21 тиждень з реєстрацією результатів кожного 3-го тижня. У контрольній групі тварин результати реєстрували через такі самі рівні інтервали часу. Це дало змогу відрізнити зміни, які пов'язані з тривалістю експерименту, від змін, які були викликані екзогенною та ендогенною ГХЕ.
Через вказані рівні проміжки часу тварин декапітували в середньому по 10 тварин у кожній групі, розтинали черевну порожнину та вилучали печінку, робили трепанацію черепа та вилучали головний мозок. Вміст кальцію в досліджуваних органах визначали методом атомно-абсорбційної спектроскопії [258-260]. При декапітації проводили ткож забір крові, у сироватці якої за методом атомно-абсорбційної спектроскопії визначали рівень кальцію. Паралельно у сироватці крові за методом Ілька вимірювали концентрацію загального ХС та ХС ЛПВЩ (після осаду інших ліпопротеїдних фракцій) [261-263]. Для вивчення змін будови тканин головного мозку та печінки за допомогою світлової мікроскопії проводили морфологічне дослідження цих тканин [264, 265].
Статистичну обробку результатів досліджень проводили з використанням методів варіаціонної статистики, які реалізовані пакетами програм статистичного аналізу ОRIGIN-6,0 і EXCEL-2000 для ПЕОМ. Розраховували значення середніх арифметичних та середньої помилки досліджуваних показників. Оцінка вірогідності відмінностей середніх величин і дисперсій проводили за критеріями Стьюдента-Фішера і Уілкоксона-Мана-Уітні. Для перевірки гіпотези про нормальний закон розподілу випадкової величини застосовували критерій Колмогорова-Смірнова. Відмінності вважали статистично вірогідними при рівні значущості не більш, ніж 0,05 (Р<0,05). Для оцінки взаємозв'язку між ознаками розраховували коефіцієнт лінійної кореляції Пірсона та рангової кореляції Спірмена [266, 267].
2.2. Визначення рівня загального холестерину і холестерину ЛПВЩ у сироватці крові
У своїй роботі ми досліджували динаміку вмісту кальцію в тканинах головного мозку та печінки інтактних тварин й тварин в умовах екзогенної та ендогенної ГХЕ. Контроль за змінами рівня загального ХС крові ми проводили шляхом визначення його у сироватці методом Ілька. Для визначення ступеня патогенності ГХЕ ми також визначали рівень ХС ЛПВЩ за даним методом, який застосовували після осаду інших ліпопротеїдних фракцій. Показник рівня ХС ЛПВЩ у сироватці крові при ГХЕ є дуже інформативним, оскільки свідчить про ефективність зворотного транспорту ХС з периферичних тканин до печінки. По співвідношенню конц