РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти досліджень
Об'єктами досліджень були: асоціативні азотфіксуючі мікроорганізми кореневої зони нагідок лікарських та валеріани лікарської, новий штам Pseudomonas fluorescens 211, біоагенти мікробних препаратів - Azospirillum brasilense 18-2 (діазобактерин), Agrobacterium radiobacter 204 (діазофіт) та консорціум штамів Azotobacter chroococcum 21 i Azotobacter vinelandii 22 (азотобактерин), збудники кореневих гнилей нагідок лікарських - Fusarium sporotrichiella Bilai var. poae Bilai, Alternaria alternata (Fr.) Keissler, Rhizoctonia DC., рослини валеріани лікарської (Valeriana officinalis L.) та нагідок лікарських (Calendula officinalis L.).
2.2. Методи досліджень
Визначення чисельності та виділення азотфіксуючих мікроорганізмів з ризосфери та ризоплани лікарських рослин проводили за загально прийнятими в ґрунтовій мікробіології методами та з використанням прийомів, що описані в оригінальних роботах авторів.
Ризосферним вважали ґрунт, який прилягав до коренів та залишався після струшування. Коріння з ризосферним ґрунтом (близько 1 г ґрунту) зважували, опускали в колбу зі стерильною водою (100 мл води) та збовтували протягом хвилини. Після цього корені виймали з колби, надлишок води збирали фільтрувальним папером, та знову зважували для визначення маси ґрунту в колбі.
За ризоплану приймали зону розміщення мікроорганізмів, що безпосередньо розвиваються на поверхні коріння рослин. Для ізоляції мікроорганізмів з ризоплани, корені шестикратно відмивали у проточній воді, потім ополіскували стерильною водою, подрібнювали і розтирали у ступці зі стерильним піском [97].
Аеробні, факультативно-анаеробні, мікроаерофільні та анаеробні азотфіксатори у кореневій зоні рослин визначали методом граничних розведень на рідкому глюкозо-автолізатному середовищі Федорова в модифікації Калінінської [58]. Для виділення азотфіксуючих бактерій використовували також напіврідкі середовища: Ешбі з цукрозою [16; 159] та Доберейнер модифікаційного складу [58]. Бактерії роду Azospirillum виділяли на середовищі Касераса з конго червоним [198], кількість азотобактера визначали методом ґрунтових грудочок [97; 159]. Псевдомонади, що продукують сидерофори виділяли на щільному середовищі Ііцука і Комагата [222]. Наявність в кореневій зоні анаеробів роду Clostridium виявляли на рідкому середовищі Виноградського [23; 159].
Виділення активних штамів азотфіксуючих мікроорганізмів проводили з накопичувальних культур після визначення нітрогеназної активності. Для цього використовували середовища Ешбі, Доберейнер та Федорова-Калінінської. Накопичувальні культури, в яких спостерігалася висока фіксація молекулярного азоту, висівали на щільні поживні середовища: картопляний агар з цукрозою, середовище Касераса з конго червоним [198] та середовище Ііцука і Комагата [222].
Для визначення нітрогеназної активності накопичувальних та чистих культур діазотрофів використовували пеніцілінові флакони. Після вирощування культур на поживних середовищах протягом трьох діб при температурі 28оС, флакони герметизували гумовими пробками і вводили ацетилен в кількості 10 % від об'єму флакона. Інкубація в атмосфері з ацетиленом тривала 20 годин [84; 161].
Перед використанням ацетилен очищали шляхом пропускання газу через 10 %-й розчин марганцевокислого калію в колбі Тищенка [99].
Здатність до азотфіксації накопичувальних культур, мікроорганізмів у чистій культурі та в асоціації з лікарськими рослинами визначали ацетиленовим методом на газовому хроматографі "Chrom-4" з полум'яно-іонізаційним детектором. Колонка довжиною 370 см була заповнена хромосорбом з ?-??оксидіпропіонітрилом. Температура термостату 500С, газ-носій - азот, витрата газів (в мл / хвилину): водню - 30, азоту - 100, повітря - 500.
Актуальну (польову) азотфіксацію визначали в непорушеному моноліті ґрунту з коренями рослин ацетиленовим методом [217; 251] в модифікації [28; 29]. Об`єм моноліту - 1000 см3 .
Визначали потенційну нітрогеназну активність в ризосфері та на поверхні коренів (в ризоплані) в залежності від джерела вуглецю - глюкози, цукрози та бурштинової кислоти, порівнюючи з ґрунтом без рослин. Корені відокремлювали від стебла і шестикратно промивали в стерильній водопровідній воді. Зразки ґрунту (7 г) та коренів (1 - 2 г) поміщали у флакони об'ємом 40 мл, додаючи 2%-ний поживний розчин. У випадку з коренями використовували напіврідкий агаризований розчин. Флакони закривали ватно-марлевими пробками і ставили в термостат на 48 годин при температурі 28 оС. Після цього пробки замінювали на гумові, в флакони вводили ацетилен в кількості 10% від об'єму повітряного простору і знову інкубували з ацетиленом протягом 20 годин. Азотфіксуючу активність виражали в нмоль С2Н4 на 1 г абсолютно сухого ґрунту або коренів за годину [8; 84; 28].
Визначення схожості та енергії проростання насіння лікарських рослин проводили в лабораторних дослідах. Насіння обробляли різними розведеннями культуральної рідини і пророщували в чашках Петрі протягом 8 діб при температурі 240С. Схожість насіння визначали по відсотку пророслого насіння, за весь період пророщування, енергію проростання визначали за кількістю насіння, вираженого в відсотках, що проросло на третю добу [34]. До уваги приймалася також маса проростків на восьму (для нагідок) та десяту добу (для валеріани).
Вивчали вплив біоагентів мікробних препаратів та виділених нами нових штамів азотфіксуючих мікроорганізмів на проростання насіння лікарських рослин. В різних розведеннях бактеріальної суспензії намочували насіння протягом 3-х годин і перекладали у чашки Петрі із зволоженим фільтрувальним папером. Крім того, для визначення найбільш оптимального бактеріального навантаження при інокуляції насіння лікарських рослин, проводили підрахунок кількості мікроорганізмів в кожному розведенні суспензії за допомогою камери Горяєва [16].
Ідентифікацію активних діазотрофів, виділених з кореневої зони ліка