РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Протягом 2004–2006 років нами було проведено клініко-лабораторне обстеження 109
жінок, які були розділені на 2 групи: І група (основна) – 58 жінок з безпліддям
трубного походження, II група (контрольна) – 51 жінка.
До контрольної групи входили соматично здорові жінки, які не мали безпліддя і в
яких уже були діти. З них один раз завагітніли й народили 68,8% жінок, двічі –
20,8 % жінок, більше двох разів – 6,3%. Штучні аборти були в анамнезі у восьми
жінок (16,6 %), самовільний викидень – у шести (1,5%). Вік жінок коливався від
17 до 45 років (у середньому 32,5±0,8 року).
2.2. Лабораторні методи дослідження
Клініко-лабораторне обстеження жінок проводили імуноферментним методом.
Імунологічні показники визначали методом моноклональних антитіл до їх
поверхневих антигенів.
Матеріалом для дослідження були сироватка крові та виділені лімфоцити.
2.2.1. Імуноферментний метод дослідження (ІФА)
Рівень статевих гормонів визначали ІФА шляхом використання набору реагентів для
кількісного імуноферментного визначення вмісту гормонів у сироватці крові:
– “ИФА-АФ-Естр”;
– “Гонадотропин ИФА-ФСГ”;
– “Гонадотропин ИФА-ЛГ”.
Принцип методу “ИФА-АФ-Естр” базується на конкуренції між адсорбованими на
поверхні лунок планшети естрадіолом (Е2) і вільним (в аналізуючому зразку) Е2
за активні центри зв'язування афінних антитіл до Е2, мічених біотипом.
Кількість зв'язаного кон'югату визначали за допомогою субстрат-хромогенної
суміші. Інтенсивність забарвлення хромогену обернено пропорційна вмісту Е2 в
аналізованому зразку. Вміст Е2 у жінок протягом менструального циклу:
– фолікулінова фаза 0,15–0,65 нмоль/л;
– пік овуляції 0,8–3,0 нмоль/л;
– лютеїнова фаза 0,25–1,1 нмоль/л.
Підготовка досліджуваного матеріалу проводилася за наступною методикою. З
ліктьової вени хворої натще забирали в центрифужну пробірку 2–3 мл крові й
ставили на 1 годину в термостат до утворення згортка. Витримані в термостаті
зразки центрифугували при 3000 об/хв протягом 10–15 хв. Відокремлену сироватку
забирали й використовували в ІФА ("Пікон №01391409).
При визначенні рівня ФСГ, ЛГ ступінь забарвлення хромогену прямо пропорційний
вмісту гормонів.
2.2.2. Дослідження функціонального стану системи імунітету
Для характеристики імунного статусу жінок груп обстеження, виявлення дефектів
та встановлення ступеня їх вираженості в клітинній, гуморальній ланках
імунітету та в системі факторів неспецифічного захисту організму ми
використовували наступний комплекс показників:
1) характеристика імунокомпетентних клітин у периферичній крові жінок одержана
шляхом визначення:
– загального аналізу крові з лейкоцитарною формулою (абсолютної кількості
лейкоцитів у х*10/л, відносної кількості паличкоядерних і сегментоядерних
нейтрофільних лейкоцитів, еозинофілів, базофілів, лімфоцитів та моноцитів);
– абсолютної (10 клітин/л) та відносної (%) кількості субпопуляцій Т- та
В-лімфоцитів (кількості СD3+ лімфоцитів, СD3+ – активних, СD4+, СD8+, СD22+);
2) функціональна активність В-лімфоцитів:
– за визначенням концентрації сироваткових ІgМ, ІgG, ІgА, титру природних
антитіл та визначення концентрації циркулюючих імунних комплексів;
3) основні характеристики функціональної активності поліморфно- ядерних
лейкоцитів крові в:
– фагоцитарній реакції за визначенням фагоцитарного числа (ФЧ) і фагоцитарної
активності (ФА) та в спонтанному НСТ-тесті за методом Рагк в модифікації
Нестерової;
4) характеристика неспецифічної ефекторної системи захисту з урахуванням
комплементарної активності та визначенням титру комплементу;
5) розрахункові параметри: лейкоцитарний індекс інтоксикації, індекс
алергізації, ефекторний індекс, імунорегуляторний індекс.
Для визначення наведеного вище комплексу показників у жінок груп обстеження
проводили забір крові з ліктьової вени в об'ємі 10 мл у період з 9 до 11 год.
Кров розливали у дві пробірки: в першу (порожню) 5 мл крові, у другу – з
додаванням гепарину (з розрахунку 5 Од/мл) теж 5 мл крові для визначення
основних класів, рівня ЦІК, титру комплементу і титру нормальних антитіл.
Загальний аналіз крові проводили за загальноприйнятою методикою з визначенням
відсоткового співвідношення імунокомпетентних клітин при підрахунку їх у камері
Горяєва.
Лейкоцитарний індекс інтоксикації(ЛІІ):
(мієлоцити + юні + паличкоядерні + сегментоядерні), % (2.1)
ЛІІ= ______________________________________________
(лімфоцити + моноцити + еозонофіли + базофіли),%
Індекс алергізації (ІА):
лімфоцити,% + 10х (еозинофіли,% + 1) (2.2)
ІА= ___________________________________________________
(паличкоядерні + сегментоядерні + моноцити + базофіли),%
Визначення основних субпопуляцій Т- та В-лімфоцитів проводили в реакції
непрямої поверхневої імунофлуоресценції з моноклональними антитілами (фірми
"Сорбент-ЛТД", Москва) до поверхневих диференційованих антигенів клітин (СD3+ –
маркер, який присутній на мембранах загальної популяції Т-клітин; СD4+ –
специфічний маркер
Т-хелперів; СD8+ – специфічний маркер Т-супресорів; СD22+ – ідентифікаційний
маркер загальної популяції В-лімфоцитів). Для визначення Т-лімфоцитів та їх
субпопуляцій, а також В-лімфоцитів використовували мишачі моноклональні
антитіла та FІТС-кон'югати вторинних антитіл фірми "ДИА-М" (Росія) з позначкою
"Флюоресцеин – изотихоцианат".
Дослідження проводили в декілька етапів:
1. Виділення лімфоцитів на градієнті щільності фікол – верографін.
Кров із ліктьової вени переносили в пробірки з 2,7% розчином Nа2ЕДТА (pH 7,4) з
розрахунку 1 мл на 10 мл крові. Для запобігання згортанню кров ретельно
перемішували з антикоагулянтом. Далі кров розводили розчином Хенкса (без іонів
Са++ і Мg++) у співвіднош
- Київ+380960830922