РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Организация экспериментов
Экспериментальная часть работы выполнена на 180 белых беспородных крысах-самцах массой 180 - 220 граммов, полученных из опытно-экспериментального питомника Института Гигиены и Медицинской Экологии, фирма "Феникс" (г. Киев) в течение 2004 - 2006 годов.
Выбор белых крыс в качестве объекта для изучения связан с тем, что имеется возможность для формирования однородных групп животных, сходных по возрасту, массе и конституциональным особенностям. Кроме того, у этих животных хорошо изучены изменения различных систем организма под влиянием факторов разной природы и интенсивности (ГК стресс, ЭМИ различных диапазонов) [46, 160, 178, 179].
В экспериментальные группы отбирали животных одинакового возраста со средней двигательной активностью и низкой эмоциональностью, определяемых в тесте ОП [29, 217], которые преобладают в популяции. Такой отбор позволил сформировать однородные группы животных, однотипно реагирующих на экспериментальные воздействия. Предварительно отобранные животные были разделены на восемь групп (табл. 2.1).
К первой группе относились животные, которые в течение девяти суток содержались в обычных условиях вивария и служили биологическим контролем (К). Крысы второй группы ежедневно подвергались воздействию ЭМИ КВЧ на затылочно-воротниковую область (КВЧ). Третью группу составляли крысы, находившиеся в условиях экспериментальной стресс-реакции, которая моделировалась ограничением подвижности (ГК) путем помещения их в специальные пеналы из оргстекла, в которых они находились в течение девяти суток эксперимента по 20 часов в сутки [78]. Крысы четвертой группы находились в условиях комбинированного воздействия ГК и ЭМИ КВЧ (ГК+КВЧ).
Таблица. 2.1.
Объем проведенных исследований (количество животных)
Экспериментальные группы животныхКоличество животных
в группеПоказатели кровиСАСКонцентрация
мелатонина в сыворотке
кровиСодеожание серотонина в лейкоцитахКонцентрация
цитокинов (ИЛ-1, 2,
4, 6 и ФНО-?) в
сыворотке кровиСинтетическая активность лимфоцитовСредняя
активность СДГ в имфоцитахСредняя
активность ?-ГФДГ в лимфоцитахЦПС пероксидазы
в нейтрофилахЦПС катионных белков в нейтрофилахЦПС кислой фосфатазы в нейтрофилахПротеазная активность в нейтрофилахСредняя активность СДГ в нейтрофилахСредняя
активность ?-ГФДГ в нейтрофилахЛейкоцитарная
формулаЦПС катехоламинов
в эритроцитахСодеожание катехоламинов в лейкоцитахК25151015101515151515151515151515КВЧ25151015101515151515151515151515ГК25151015101515151515151515151515ГК+КВЧ25151015101515151515151515151515К+Н20101010101010101010101010101010КВЧ+Н20101010101010101010101010101010ГК+Н20101010101010101010101010101010ГК+КВЧ+Н20101010101010101010101010101010Всего животных 1801008010080100100100100100100100100100100100 Примечание. К - контроль; КВЧ - воздействие ЭМИ КВЧ; ГК - гипокинезия; КВЧ+ГК - комбинированное воздействие ЭМИ КВЧ и гипокинезии; Н - введение налоксона животным дополнительно к экспериментальным воздействиям; остальные сокращения и списке условных сокращений.
С целью блокирования рецепторов ОпП применялся налаксон, который является ((-)-17-аллил-4,5(-эпокси-3,14-дигидроксиморфин-6-он) гидрохлорида дигидратом, принадлежит к группе неселективных блокаторов всех субтипов ОР, устраняет центральное и периферическое действие ОпП, включая эндогенные эндорфины, проникает через гематоэнцефалический и плацентарный барьеры. Препарат при внутримышечном введении начинает действовать через 2-3 минуты, продолжительность действия 2,5-3 часа. Средний период полураспада составляет 1,0 - 1,5 часа [102].
Налоксон (Налоксон-М 0,04% раствор по 1 мл в ампулах, разработка ГНЦЛС, г. Харьков и ХГФП "Здоров'я народу") в дозе 0,4 мг/кг дополнительно с описанными экспериментальными воздействиями вводился крысам пятой (К+Н), шестой (ГК+Н), седьмой (КВЧ+Н) и восьмой (ГК+КВЧ+Н) групп внутримышечно (наружная поверхность бедра) в течение девяти дней эксперимента в одно и то же время с 8.00 до 10.00 часов за 30 минут до КВЧ-воздействия.
Забор крови для цитохимических исследований осуществлялся в первые, пятые и девятые сутки эксперимента; для микроспектрального люминесцентного анализа - в первые, третьи, пятые, седьмые и девятые сутки наблюдения путем пункции хвостовой вены.
В мазках крови цитохимическими методами проводилось исследование следующих показателей периферической крови: средней активности СДГ в лимфоцитах и нейтрофилах; средней активности ?-ГФДГ в лимфоцитах и нейтрофилах, ЦПС ПО, КБ, КФ, ПР в нейтрофилах; ЦПС КА в эритроцитах; лейкоцитарной формулы. Люминесцентным микроспектральным методом определяли показатель синтетической активности лимфоцитов, содержание СТ и КА в лейкоцитах.
Сыворотку крови для исследования содержания МТ и цитокинов получали путем моментальной декапитации на девятые сутки наблюдения с 9 до 12 часов дня.
Крыс содержали в условиях вивария при температуре 18 - 22оС на стандартном пищевом рационе и в стандартных условиях освещения (12 часов темнота : 12 часов свет). Световая фаза начиналась в 7.00 утра. Эксперименты проводились с соблюдением принципов "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей" (Страсбург, 2000), постановления первого национального конгресса по биоэтике (Киев, 2001), закона Украины №3447-IV "Про захист тварин від жорстокого походження" от 21.20.2006 [59].
Все исследования и измерения осуществлялись на оборудовании, прошедшем метрологическую поверку и экспертизу.
2.2. Методика формирования однородных групп
Одним из объективных методов оценки изменений эмоционально-поведенческих реакций крыс является тест ОП [29, 217]. В условиях новой обстановки ОП экспериментальные жив